針刀對膝骨關(guān)節(jié)炎兔股直肌組織硬度和纖維化的影響

宮玉榕 林巧璇 劉 晶 郭澤興 盧莉銘 修忠標(biāo)

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，福建福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院骨傷科，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院骨傷一科，福建福州 350004；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是導(dǎo)致中老年患者膝痛和下肢功能障礙的常見病。膝關(guān)節(jié)動態(tài)力平衡失調(diào)可造成骨骼肌慢性損傷，引起力學(xué)性能下降，繼而加重筋骨失衡，導(dǎo)致持續(xù)軟骨面異常機(jī)械應(yīng)力，加劇軟骨退變，這是KOA 發(fā)病重要機(jī)制之一[1]。骨骼肌慢性損傷修復(fù)過程會形成纖維化，嚴(yán)重影響骨骼肌功能[2]。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示針刀松解股四頭肌常見經(jīng)筋病灶點(diǎn)可調(diào)整下肢力線，延緩軟骨退變[3]；并通過實(shí)時(shí)組織彈性成像發(fā)現(xiàn)KOA 兔股直肌彈性應(yīng)變率比值增高[4]。那么，針刀治療KOA 的作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)股直肌組織硬度和改善其纖維化相關(guān)，目前鮮有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探討從股直肌組織硬度和纖維化角度探討針刀治療KOA 的作用機(jī)制，為針刀治療KOA 的力學(xué)效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選取24 只6 月齡普通級健康雄性新西蘭兔，體重為（2.2±0.3）kg。實(shí)驗(yàn)動物的購買和飼養(yǎng)均由許可證號為SYXK（閩）2019-0007 的福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心完成。參照隨機(jī)數(shù)字表法，將實(shí)驗(yàn)兔分為3 組，分別是空白組、模型組、針刀組，每組各8 只。本研究經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批號：FJTCMIACUC），整個實(shí)驗(yàn)過程均符合有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定[5]。

1.2 主要試劑與儀器

Masson 染色試劑盒、4%多聚甲醛（G1340、P1110，北京索萊寶）；戊巴比妥鈉（P1110，德國Sigma）；戊二醛（F-A17876，美 國AlaAesar）；10%EDTA（GL1794，北京百奧萊博）；一次性使用無菌針刀（202007006，江西老宗醫(yī)）；全數(shù)字化彩色超聲波診斷儀（日本日立HI VISION Avius L）；光學(xué)顯微鏡（Motic BA210，深圳博視達(dá)光學(xué)）；自動脫水機(jī)（KL-T1，湖北康龍電子）；組織包埋機(jī)（BMJ-A，常州中威電子）；石蠟切片機(jī)（RM2235，德國Leica）；高分子石膏（AX002，陜西安信）。

1.3 模型制備

采用本團(tuán)隊(duì)前期研究的改良Videman 法[6]制備兔左膝KOA 模型。固定6 周后，模型評價(jià)方法采用Lequesne 膝關(guān)節(jié)評估法[7]，具體包括疼痛、步態(tài)、活動度、腫脹情況4 個方面，當(dāng)Lequesne MG 評分≥4 分，判定為兔左膝KOA 模型制備成功。

1.4 干預(yù)措施

空白組和模型組采取同樣的抓取和固定，但不予針刀治療。針刀組治療點(diǎn)為左后肢的“鶴頂次”“髕外上” “髕內(nèi)上”，在施術(shù)部位定點(diǎn)、備皮消毒后，使用0.4 mm×40 mm 一次性無菌針刀進(jìn)行松解。每7 天干預(yù)1 次，干預(yù)4 次。

1.5 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.5.1 Masoon 染色觀察股直肌組織形態(tài)、膠原纖維含量及膠原容積分?jǐn)?shù)改變。腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）麻醉后耳緣靜脈空氣栓塞處死，取左膝髕上1～3 cm 股直肌，4%多聚甲醛中固定24 h 后常規(guī)脫水，包埋，切片，制片。采用Masoon 染色試劑盒對標(biāo)本行常規(guī)染色，脫水，透明，封片。鏡下觀察、攝片，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（軟件Image J，膠原容積分?jǐn)?shù)=統(tǒng)一視野中膠原面積/所測視野面積）。

1.5.2 實(shí)時(shí)組織彈性成像檢測股直肌彈性應(yīng)變率比值評估股直肌組織硬度改變。麻醉后行左膝關(guān)節(jié)超聲檢測。使用日立彩超HI VISION Avius L 儀器，選取彈性成像模式，運(yùn)用5～15 MHz 高頻線陣探頭于髕上2 cm股直肌正上方的長軸進(jìn)行彈性成像。采用超聲彈性成像分析軟件計(jì)算股直肌的彈性應(yīng)變率比值（彈性應(yīng)變率比值=感興趣點(diǎn)彈性應(yīng)變值/皮下組織彈性應(yīng)變值），反復(fù)測量3 次。彈性成像圖以紅色到藍(lán)色表示組織從“軟”到“硬”。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較使用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刀對KOA 兔股直肌彈性超聲特征影響

空白組股直肌彈性成像呈綠色為主夾雜少許紅色的低彈性圖；模型組股直肌彈性成像呈藍(lán)色為主的高彈性圖；針刀組股直肌彈性成像呈藍(lán)綠相間的中彈性圖。與空白組比較，模型組股直肌彈性應(yīng)變率比值升高（P ＜0.05）；與模型組比較，針刀組股直肌彈性應(yīng)變率比值下降（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 各組兔股直肌彈性超聲成像結(jié)果比較

2.2 針刀對KOA 兔股直肌Masson 染色結(jié)果影響

空白組骨骼肌肌纖維均勻紅染，排列整齊，無明顯藍(lán)色膠原纖維生成；模型組可見明顯骨骼肌肌纖維破壞，肌纖維間隔增大，大量藍(lán)染的膠原纖維沉積在骨骼肌肌纖維破壞處、新生肌細(xì)胞、肌間膜處，肌纖維化形成；針刀組可見散在骨骼肌肌纖維破壞，肌纖維間隔較模型組減小，骨骼肌肌纖維破壞處、新生肌細(xì)胞、肌間膜處有少量藍(lán)染的膠原纖維沉積，纖維化程度減小。模型組股直肌膠原容積分?jǐn)?shù)較空白組增加（P ＜0.05）；針刀組股直肌膠原容積分?jǐn)?shù)較模型組減?。≒ ＜0.05）。見圖1。

圖2 各組兔股直肌Masson 染色結(jié)果比較（400×）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膝為筋之府，“筋束骨，骨張筋”，“骨正筋柔”調(diào)和狀態(tài)可維持膝關(guān)節(jié)正常生理功能[9]。倘若筋骨平衡失調(diào)出現(xiàn)“筋出槽、骨錯縫”病理狀態(tài)，骨骼肌遭受累積性應(yīng)力導(dǎo)致氣血運(yùn)行障礙，代謝產(chǎn)物堆積，形成粘連、瘢痕，產(chǎn)生疼痛和下肢功能障礙而發(fā)KOA[10]。針刀為中醫(yī)原創(chuàng)技術(shù)，擅長松解粘連、瘢痕，疏通堵塞，調(diào)節(jié)病變軟組織力學(xué)性能[11]，改善軟骨力學(xué)結(jié)構(gòu)[12]和免疫微環(huán)境[13]，延緩軟骨退變[14]，從而有效改善KOA 疼痛和下肢功能障礙[15]。然而，其對骨骼肌慢性損傷修復(fù)的作用機(jī)制尚不明確。慢性骨骼肌損傷形成的粘連、瘢痕特征為組織硬度增加[16]，病理改變與骨骼肌纖維化相關(guān)[17]。實(shí)時(shí)組織彈性成像也能檢測病灶區(qū)彈性變化評價(jià)治療前后軟組織硬度情況[18]，彈性應(yīng)變率比值與組織硬度呈正相關(guān)，值越大說明組織硬度越高[19]。Masson 染色可以很好地反映骨骼肌纖維化程度[20]。因此，本研究憑借Masson 染色和超聲彈性成像技術(shù)從股直肌組織硬度和纖維化角度探討針刀治療KOA 的作用機(jī)制。

本研究中，模型組股直肌彈性成像呈藍(lán)色為主的高彈性圖，模型組股直肌彈性應(yīng)變率比值較空白組明顯升高；且模型組股直肌可見明顯骨骼肌細(xì)胞破壞，大量藍(lán)染的膠原纖維填充在骨骼肌細(xì)胞破壞處，肌膠原纖維和膠原容積分?jǐn)?shù)較空白組增加。提示改良Videman 法固定兔左后肢6 周可導(dǎo)致股直肌組織硬度增加和纖維化改變。相關(guān)研究表明持續(xù)異常機(jī)械應(yīng)力可以介導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡[21]，機(jī)體在自我修復(fù)過程中大量膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致組織硬度增加和嚴(yán)重骨骼肌纖維化[22]，與研究結(jié)果具有一致性。而針刀干預(yù)后股直肌彈性成像呈藍(lán)綠相間的中彈性圖針刀組股直肌彈性應(yīng)變率比值、膠原纖維含量和膠原容積分?jǐn)?shù)較模型組下降，提示針刀可以改善KOA 兔股直肌組織組織硬度和纖維化程度。既往研究表明，針刀減少骨骼肌細(xì)胞凋亡[23]，促進(jìn)骨骼肌病理形態(tài)和功能修復(fù)[24-25]，這與本研究結(jié)果一致。

綜上，針刀可以改善KOA 兔股直肌組織硬度，促進(jìn)股直肌慢性損傷纖維化的修復(fù)，這可能是針刀治療KOA 的力學(xué)效應(yīng)機(jī)制之一。但本研究樣本量較小，而且本研究超聲設(shè)備無剪切波彈性成像功能，未能通過具體的彈性模型值對股直肌組織硬度進(jìn)行定量評估，有待進(jìn)一步大樣本量實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)針刀對骨骼肌慢性損傷修復(fù)作用。