HPLC法測定不同來源低聚肽粉中4種呈味有機(jī)酸含量

石可歆，張偉偉, ，馬躍欣，張紫藝，楊 晨，汪建明

(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.山東天博食品配料有限公司，濟(jì)寧 272000)

有機(jī)酸是食品中重要的風(fēng)味組成成分，能有效改善食品風(fēng)味，防止或減緩食品酸敗和褐變反應(yīng).有機(jī)酸通常包括乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等，其中琥珀酸在與味精(MSG)結(jié)合時有強(qiáng)烈的增香作用[1-2].研究[3]表明，魚類中乳酸的含量普遍較高，而水果中含有較多的檸檬酸.

目前檢測呈味有機(jī)酸含量的方法主要有毛細(xì)管電泳法[4]、氣相色譜法[5]、離子色譜法[6]及高效液相色譜法(HPLC)[7-8]等.毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性較差；氣相色譜法操作比較復(fù)雜，安全性較低；離子色譜法檢測耗時較長；高效液相色譜法操作簡單、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性高，目前已經(jīng)大范圍應(yīng)用到食品中呈味有機(jī)酸的檢測.丁奇[9]確定了一種利用高效液相色譜檢測雞湯中呈味有機(jī)酸的方法，并檢測出雞湯中只含有乳酸和琥珀酸兩種有機(jī)酸.Xiao等[10]利用HPLC法在四川泡菜中檢測出6種有機(jī)酸(乳酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸和丁酸)，并發(fā)現(xiàn)乙酸和乳酸是發(fā)酵過程中的主要酸產(chǎn)物.但是，目前尚未見到利用高效液相色譜法檢測低聚肽(由2～10個氨基酸組成的肽)中的有機(jī)酸含量的研究.利用高效液相色譜檢測呈味有機(jī)酸的方法中，不同的液相色譜條件(如緩沖液濃度、流動相流量、色譜柱等)會明顯影響檢測的分離度、檢測限、精密度等.對于不同的食品原料，其呈味有機(jī)酸檢測的最適色譜條件需要進(jìn)一步研究確定.因此，本實驗擬對低聚肽中呈味有機(jī)酸的高效液相色譜檢測方法進(jìn)行探究.

前期研究表明，雞肉經(jīng)蛋白酶酶解得到的低聚 肽[11-12]具有抗氧化[13-14]、降血壓[15-16]、抗疲勞[17]、調(diào)節(jié)免疫力[18-19]等作用，且具有良好的呈味特性[20-21].經(jīng)過酶解得到的雞肉低聚肽與大豆蛋白的氨基酸組成相同[22]，且具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、降低膽固醇、降血壓、抗疲勞、增強(qiáng)肌肉力量、提高免疫力等多種生理功能[23].雞肉低聚肽[24]和大豆低聚肽[25-26]都具有良好的呈鮮特性，能在一定程度上改善食品風(fēng)味.而其中含有的呈味有機(jī)酸雖然含量低，卻能夠顯著提高食品的滋味，且不會改變食品的酸度[24,27].然而，現(xiàn)階段對低聚肽中呈味有機(jī)酸的檢測方法尚未見報道.因此，利用高效液相色譜法測定雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉中呈味有機(jī)酸的含量，對深入了解呈味有機(jī)酸的呈味特征具有重要意義，可以為開發(fā)營養(yǎng)型鮮味調(diào)味品提供新思路，彌補(bǔ)普通調(diào)味品營養(yǎng)成分含量不高、鮮味較為單一的不足.

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

雞肉低聚肽粉、大豆低聚肽粉是由雞肉、大豆原料經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解制備而成，相對分子質(zhì)量小于3000，山東天博食品配料有限公司生產(chǎn).

甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)、磷酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品(98.7%，BePure)、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品(90.2%，BePure)、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品(99.9%，BePure)、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%，BePure)，北京振翔科技有限公司；實驗用水為超 純水.

e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；ME204型分析電子天平、FE28型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 樣品基本成分檢測

粗蛋白含量按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法進(jìn)行測定.粗脂肪含量按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法進(jìn)行測定.灰分含量按照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》中的干法灰化法進(jìn)行測定.碳水化合物含量按照GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測定》進(jìn)行測定.氨基酸態(tài)氮含量按照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》進(jìn)行測定.

1.2.2 有機(jī)酸檢測的色譜條件

有機(jī)酸檢測的色譜條件根據(jù)丁奇[9]、蘇國萬[28]、Fang等[29]的方法加以改進(jìn).色譜柱為Zorbax Eclipse XDB C18色譜柱，柱溫25℃，流動相為體積比5∶95的甲醇與磷酸二氫鉀溶液(0.01mol/L，pH 2.8)的混合溶液，流量1mL/min，進(jìn)樣量5μL，等度洗脫，紫外檢測器檢測波長210nm.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精確稱取適量蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品(按純度計算)，用超純水超聲溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為25mg/mL的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃儲存?zhèn)溆?分別取上述儲備液，用超純水稀釋成質(zhì)量濃度為5mg/mL的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合使用液.

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，用超純水稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/mL的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別用0.22μm濾膜過濾后連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行測定.以有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，對結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.5 樣品處理

精確稱取雞肉低聚肽粉2.00g，用超純水超聲溶解并定容至100mL，配制成20mg/mL的雞肉低聚肽樣品溶液.精確稱取大豆低聚肽粉5.00g，用超純水超聲溶解并定容至100mL，配制成50mg/mL的大豆低聚肽樣品溶液.樣品溶液用0.22μm濾膜過濾后置于樣品瓶中，用于呈味有機(jī)酸含量的測定.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin8.0、SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.每組平行檢測3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基本組成成分

對雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉中的粗蛋白、粗脂肪、灰分、碳水化合物、氨基酸態(tài)氮進(jìn)行測定，并與雞肉和大豆原料中的基本成分進(jìn)行對比(以干質(zhì)量計)，結(jié)果見表1.

表1 樣品的基本組成成分 Tab.1 Basic components of samples

由表1可知：兩種低聚肽樣品中的粗蛋白含量皆大于50%，且遠(yuǎn)高于其原料(雞肉/大豆)中的粗蛋白含量，其他基本成分相對較少.這是由于兩種低聚肽樣品都是原料(雞肉/大豆)經(jīng)特定方法酶解后的肽提取物，同時將酶解后的兩種原料酶解液分別經(jīng)500nm的陶瓷膜純化，以除去脂肪、多糖等大分子.相較于大豆低聚肽粉，雞肉低聚肽粉中的粗蛋白含量更高，超過了75%，而大豆低聚肽粉中除了粗蛋白，還含有約30%的碳水化合物，且大多為不可溶性膳食纖維[29].由此可以推斷，利用大豆制備大豆低聚肽的酶解方法還有待進(jìn)一步改善.另外，雖然兩種低聚肽樣品中的粗脂肪和氨基酸態(tài)氮含量都很少，但是雞肉低聚肽粉中的粗脂肪含量(6.9%)和氨基酸態(tài)氮含量(3.5%)約為大豆低聚肽粉(粗脂肪含量2.1%，氨基酸態(tài)氮含量1.1%)的3倍.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的選擇

分別對4種呈味有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品在200～300nm處進(jìn)行全波長掃描(圖1)，發(fā)現(xiàn)各種有機(jī)酸在210nm處均有較大的吸收峰，故采用210nm作為檢測波長.

圖1 有機(jī)酸全波段掃描結(jié)果 Fig.1 Full band scanning results of organic acid

2.2.2 流動相的選擇

流動相的組成影響HPLC檢測結(jié)果的峰形和分離效果.研究[9,29-31]表明，用甲醇和磷酸二氫鉀溶液混合后的流動相可以實現(xiàn)待測物的分離.流動相的磷酸二氫鉀濃度及pH對保留時間的影響如圖2所示.

圖2 流動相的磷酸二氫鉀濃度及pH對保留時間的影響Fig.2 Influence of mobile phase concentration and pH on retention time

磷酸二氫鉀由于水溶性好且是一種弱酸電離抑制劑，在紫外光區(qū)幾乎無吸收，所以常被用作緩沖溶液；用其作為檢測有機(jī)酸的流動相，有利于有機(jī)酸的分離且不影響檢測結(jié)果，但其濃度過高易造成儀器的腐蝕并且清洗困難.本實驗分別比較了0.01、0.05、0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液對4種呈味有機(jī)酸分離效果的影響，結(jié)果如圖2(a)所示.隨著磷酸二氫鉀濃度的增大，4種有機(jī)酸的分離效果稍有增強(qiáng).在磷酸二氫鉀濃度為0.01mol/L、流動相甲醇與磷酸二氫鉀溶液的體積比為5∶95時，4種有機(jī)酸的分離度皆大于1.5.由于磷酸鹽濃度過高會對儀器及色譜柱造成損害，所以選用濃度為0.01mol/L的磷酸二氫鉀溶液進(jìn)行后續(xù)實驗.

由于有機(jī)酸為弱酸，極性較大，大部分以解離形式或結(jié)合態(tài)形式存在，只有少部分以分子形式存在，而較低pH的流動相可以抑制有機(jī)酸解離，促進(jìn)其向分子形式轉(zhuǎn)換.本實驗分別比較了在流動相pH 2.1、pH 2.8、pH 3.5時4種呈味有機(jī)酸的分離效果，結(jié)果如圖2(b)所示.隨著流動相pH的升高，各組分出峰時間變短，且對蘋果酸的影響最大，但pH的降低會增加色譜柱的損傷.當(dāng)流動相的pH為2.8時，4種有機(jī)酸的保留時間較短、分離度較好，所以選用流動相的pH為2.8進(jìn)行后續(xù)實驗.

2.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限、定量限

取質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/mL的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣檢測，以有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為自變量，色譜峰面積為因 變量，對結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析.此外，將有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋后上樣檢測，以3倍信噪比(S/N)作為各有機(jī)酸的檢出限(LOD)，以10倍信噪比作為各有機(jī)酸的定量限(LOQ)，測定儀器所能檢出和定量的最低質(zhì)量濃度.4種1mg/mL呈味有機(jī)酸混合對照品溶液的高效液相色譜圖如圖3所示，其中富馬酸為蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品中的雜質(zhì).線性回歸方程、決定系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限見表2.

圖3 1mg/mL呈味有機(jī)酸混合對照品溶液的高效液相色譜圖 Fig.3 High performance liquid chromatography of 1mg/mL of flavor organic acid mixed reference solution

表2 4種呈味有機(jī)酸回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限 Tab.2 Regression equation，linear range，limit of detection and limit of quantification of four flavor organic acids

由表 2可知：4種呈味有機(jī)酸在0.01～5.00mg/mL線性范圍內(nèi)，回歸方程的決定系數(shù)(R2)在0.99941～1.00000之間，表明各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品均具有良好的線性關(guān)系.同時，4種呈味有機(jī)酸的LOD在0.4～0.9μg/mL之間，LOQ在2.9～5.4μg/mL之間.現(xiàn)有的色譜條件下，各有機(jī)酸的LOD與LOQ均在線性范圍內(nèi)，說明各有機(jī)酸在0.01～5.00mg/mL的范圍內(nèi)可被準(zhǔn)確定量.

2.4 方法精密度

對質(zhì)量濃度100μg/mL的呈味有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)進(jìn)樣6次，計算其精密度(表3).由表3可知，各標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.51%～0.89%之間，表明該方法的精密度達(dá)到分析要求.

表3 測定方法的精密度 Tab.3 Precision of the determination method

2.5 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確量取按照1.2.5節(jié)方法配制的雞肉低聚肽樣品溶液25mL(含雞肉低聚肽粉0.50g)和大豆低聚肽樣品溶液10mL(含大豆低聚肽粉0.50g)，向其中分別加入不同濃度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行呈味有機(jī)酸的3水平6平行加標(biāo)回收實驗.分別選取低、中、高3個加標(biāo)水平(2.50%、5.00%、7.50%)，結(jié)果見表4.雞肉低聚肽和大豆低聚肽樣品中4種呈味有機(jī)酸的加標(biāo)回收率分別在88.69%～94.36%之間和86.25%～92.19%之間，且RSD均小于5%，表明方法回收率較好、準(zhǔn)確度高.

表4 有機(jī)酸加標(biāo)回收率(n＝6) Tab.4 Standard recovery rate of organic acids(n＝6)

2.6 呈味有機(jī)酸含量

按1.2.2節(jié)有機(jī)酸檢測色譜條件及1.2.5節(jié)原料制備方法對雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉中的4種呈味有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示.

圖4 雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉的呈味有機(jī)酸含量 Fig.4 Organic acid content of chicken and soybean oligopeptide powder

雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉中都只有極少量的呈味有機(jī)酸.雞肉低聚肽粉中4種呈味有機(jī)酸含量在0.00%～4.32%之間(蘋果酸1.31%、乳酸4.32%、檸檬酸0.00%、琥珀酸2.68%).大豆低聚肽粉中4種呈味有機(jī)酸含量在0.07%～1.91%之間(蘋果酸 0.07%、乳酸0.15%、檸檬酸1.91%、琥珀酸1.15%).兩種樣品中的呈味有機(jī)酸總含量存在明顯差異，雞肉低聚肽粉中雖然不含有檸檬酸，但其4種呈味有機(jī)酸的總含量卻遠(yuǎn)大于大豆低聚肽粉的.與此同時，兩種樣品中占主導(dǎo)地位的呈味有機(jī)酸也完全不同，雞肉低聚肽粉中乳酸的含量最高(4.32%)，琥珀酸次之(2.68%)，不含檸檬酸；而大豆低聚肽粉中檸檬酸(1.91%)則是含量最高的呈味有機(jī)酸，蘋果酸含量最少(0.07%).這可能與雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉分別是動物性食品和植物性食品有關(guān).

不同食品中的有機(jī)酸含量見表5.有報道指出：魚類、雞肉中乳酸含量普遍較高，是最主要的呈味有機(jī)酸，乳酸本身就是一種酸味柔和的調(diào)味劑[32-33]；水果中常常含有較多的檸檬酸或蘋果酸，檸檬酸有溫和而爽快的酸味[34]，而蘋果酸相較于檸檬酸的酸味更強(qiáng)卻具有特殊的、令人愉悅的香味[30-31]；腌制品中起到助鮮作用的則是乳酸和琥珀酸，琥珀酸具有一種類似于貝類的鮮味[35-36].這些研究結(jié)果與本實驗結(jié)果基本一致.

此外，研究[41]表明，雖然有機(jī)酸在食品中的含量極低，但在很低的濃度下，有機(jī)酸仍能顯著提高食品的滋味強(qiáng)度.同時，本實驗結(jié)果顯示，雞肉低聚肽和大豆低聚肽溶液的pH都接近于中性，由此可以得出，這些含量極少的有機(jī)酸在食品體系中主要起到提高風(fēng)味質(zhì)量的作用，并不會導(dǎo)致食品產(chǎn)生酸味，這與文獻(xiàn)[42-43]報道的結(jié)果一致.

3 結(jié) 論

本研究建立了一種利用高效液相色譜測定雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉中4種呈味有機(jī)酸(蘋果酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸)含量的方法.該高效液相色譜方法分離度較好，4種呈味有機(jī)酸在0.01～5.00mg/mL線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，各有機(jī)酸的檢出限為0.4～0.9μg/mL，定量限為2.9～5.4μg/mL，該方法可準(zhǔn)確定量.對雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉樣品各平行測定6次，各呈味有機(jī)酸含量的RSD均小于1%；3水平6平行加標(biāo)回收實驗結(jié)果顯示，兩種樣品的呈味有機(jī)酸加標(biāo)回收率為86.25%～94.36%，且RSD均小于5%，該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度.

利用該方法有效測定了雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉中4種呈味有機(jī)酸的含量，結(jié)果表明兩種樣品的呈味有機(jī)酸總含量存在明顯差別.值得注意的是，雞肉低聚肽粉中不含有檸檬酸，但其4種呈味有機(jī)酸的總含量遠(yuǎn)大于大豆低聚肽粉的.雞肉低聚肽粉中各呈味有機(jī)酸含量由高到低依次為乳酸、琥珀酸、蘋果酸，而大豆低聚肽粉中各呈味有機(jī)酸含量由高到低則依次為檸檬酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸.這些差別可能與雞肉低聚肽粉和大豆低聚肽粉分別是動物性食品和植物性食品有關(guān).食品中呈味有機(jī)酸含量對食品的呈味效果有顯著影響，是決定食品風(fēng)味和品質(zhì)的重要因素.因此，對食品中各呈味有機(jī)酸含量的測定及其對食品風(fēng)味的影響機(jī)理仍有待進(jìn)一步的研究.本研究為其他種類食品中呈味有機(jī)酸含量檢測提供參考，同時為進(jìn)一步研究不同食品中有機(jī)酸含量、代謝與食品風(fēng)味品質(zhì)變化的關(guān)系提供了基礎(chǔ)的技術(shù)手段.

致謝：本研究為基于2021年天津市教育科學(xué)規(guī)劃(重點)課題校企深度融合的路徑創(chuàng)新研究(BIE210023)的研究成果，引導(dǎo)本科生參與了課題實踐.