大豆豆粕及赤小豆膳食補(bǔ)充對(duì)鼠傷寒沙門氏菌 侵染小鼠腸道炎癥的影響

李 萍，蘇佳麗，杜欣軍，王 碩

(1.食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457； 2.天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071)

膳食成分會(huì)顯著調(diào)節(jié)腸道菌群，影響腸道代謝功能[1].目前大量研究表明膳食中的多糖、纖維以及一些植物提取物等均有一定的抑菌作用.Sweeney等[2]發(fā)現(xiàn)海藻多糖可以促進(jìn)乳酸桿菌的生長(zhǎng)，抑制鼠傷寒沙門氏菌的繁殖.另一項(xiàng)研究[3]發(fā)現(xiàn)可發(fā)酵纖維菊粉可以抑制艱難梭菌的繁殖.Parson等[4]發(fā)現(xiàn)食用可溶性車前草纖維可以防止鼠傷寒沙門氏菌入侵雞的腸黏膜.此外，還有研究表明檳榔[5]、茶籽殼[6]、石榴 皮[7]、黑豆花色苷[8]、綠茶和葡萄籽[9]等均對(duì)一些致病菌有顯著的抑制作用.

豆科在中國(guó)有172個(gè)屬，其中食用類最常見(jiàn)的是大豆和赤小豆.大豆也稱為黃豆，為雙子葉植物綱豆科大豆屬，其種子含有豐富的蛋白質(zhì).大豆異黃酮[10]在抑菌、免疫方面有顯著作用.將大豆中的油榨取之后所剩下的大豆豆粕是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料，常被添加進(jìn)動(dòng)物飲食中.赤小豆也稱為赤豆、朱豆，為雙子葉植物綱豆科豇豆屬，其作為藥食同源的物質(zhì)之一，主要含有黃酮類化合物和膳食纖維等物質(zhì)，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗菌、降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)血糖等多種作用[11].研究[12]表明，赤小豆乙醇提取物可以減輕醋酸性結(jié)腸炎大鼠的體質(zhì)量損失，降低相應(yīng)炎癥指標(biāo)水平，保護(hù)大鼠的結(jié)腸免受損傷.Park等[13]采用體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了赤小豆提取物可以改善小鼠敗血癥的死亡情況，調(diào)節(jié)炎癥水平.大豆和赤小豆中的成分均被報(bào)道有抑菌、增強(qiáng)免疫力等功能，可能對(duì)食源性致病菌侵染導(dǎo)致的腸炎有一定的緩解作用.

鼠傷寒沙門氏菌是一種常見(jiàn)的全球食源性病原體，幾乎可以侵染一切動(dòng)物，可引起多種人畜疾病，包括急性腸胃炎、菌血癥及腸外局部感染[14].經(jīng)過(guò)研究相關(guān)數(shù)據(jù)，沙門氏菌感染比其他任何細(xì)菌病原體感染造成的死亡人數(shù)都多，大多數(shù)沙門氏菌病通過(guò)食物傳播，其中鼠傷寒沙門氏菌通常在牛、豬和雞中被發(fā)現(xiàn)，人類通常通過(guò)食用未煮熟或受污染的食物而感 染[14-15].在沙門氏菌的感染病例中，鼠傷寒沙門氏菌約占三分之一，且鼠傷寒沙門氏菌是從致命沙門氏菌感染患者體內(nèi)分離出來(lái)的最常見(jiàn)的沙門氏菌血清 型[15].鼠傷寒沙門氏菌可以在多種宿主中引起腸道感染，尤其是溫血?jiǎng)游锔腥敬蠖嘤墒髠抽T氏菌引起[16].鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028可以通過(guò)口腔進(jìn)入消化道，侵入小腸黏膜上皮細(xì)胞，隨后定殖于肝臟和脾臟中，并通過(guò)血液傳播到全身各個(gè)部位，引起機(jī)體不良反應(yīng)[17].目前臨床針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的感染主要使用抗生素藥物進(jìn)行治療，如喹諾酮和頭孢曲松等[18]，但也因此出現(xiàn)了耐藥性，而飲食干預(yù)作為新的防治手段，還沒(méi)有應(yīng)用到沙門氏菌侵染的疾病治療中.BALB/c小鼠對(duì)沙門氏菌較為敏感，會(huì)患上一種類似人類傷寒的全身性致命疾病[19].目前針對(duì)結(jié)腸炎等胃腸道疾病的研究[20]主要通過(guò)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)，本研究直接使用鼠傷寒沙門氏菌對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行侵染，更直觀地反映出人類受到致病菌侵染時(shí)的一系列免疫反應(yīng).小鼠基礎(chǔ)飼料中含有一定量的大豆豆粕，而大豆和赤小豆中的成分均被報(bào)道有抑菌、增強(qiáng)免疫等功能，可能對(duì)鼠傷寒沙門氏菌侵染導(dǎo)致的腸炎有一定的緩解作用.因此，本研究使用玉米淀粉或者赤小豆代替豆粕部分，通過(guò)調(diào)整飼料中的豆類對(duì)小鼠進(jìn)行膳食干預(yù)，探討其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌引起的急性腸炎的緩解作用.

1 材料與方法

1.1 材料

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)BALB/c雌性小鼠，6周齡，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2019—0010；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella entericaserotype Typhimurium) ATCC14028，天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；小鼠飼料，納瑞增(天津)生物科技有限公司.

蘆丁，上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉，阿拉丁試劑(上海)有限公司；硝酸鋁，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇，天津市百世化工有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；玉米淀粉，南京甘汁園糖業(yè)有限公司；明膠(食品級(jí))，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；赤小豆，安徽燕之坊食品有限公司；大豆豆粕，納瑞增(天津)生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，南京建成科技有限公司.

HCJ-4C型磁力攪拌水浴鍋，蘇州東鵬儀器制造有限公司；K480-22H型超聲波清洗儀，昆山歐華超聲科技有限公司；5424C150339型臺(tái)式離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；LBI-250型生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；SCIENTA-48型高通量組織研磨機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；OHG-914385型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MR–96A型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)選用50只SPF級(jí)6周齡的BALB/c雌性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小鼠每籠5只，在相對(duì)濕度60%～80%、溫度(22±2)℃、光/暗周期12h/12h的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由取食和飲水.所有小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)適應(yīng)1周，適應(yīng)期結(jié)束后實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為淀粉正常組(starch control group，ST)、淀粉侵染組(starch infection group，STI)、大豆豆粕侵染組(soybean meal infection group，SBMI)、5%赤小豆侵染組(5% red bean infection group，5%RBI)、10%赤小豆侵染組(10% red bean infection group，10%RBI).淀粉正常組和淀粉侵染組繼續(xù)喂食普通飼料，其余3組喂食相應(yīng)飼料4周進(jìn)行膳食干預(yù)，每周稱量一次小鼠體質(zhì)量并記錄.在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始5周后每組選取狀態(tài)最好的8只開(kāi)始進(jìn)行灌胃，侵染組灌胃鼠傷寒沙門氏菌的菌懸液，每只小鼠單次的灌胃菌數(shù)為1.0×107個(gè)，菌懸液體積為0.1mL，連續(xù)灌胃6d，正常組灌胃相同體積的生理鹽水.其間每天記錄小鼠體質(zhì)量與死亡情況，在第3天與第6天對(duì)小鼠糞便中的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行計(jì)數(shù).鼠傷寒沙門氏菌侵染結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血并測(cè)定血清中的炎癥因子，斷頸后解剖小鼠，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并對(duì)結(jié)腸進(jìn)行病理切片[21-22].

1.2.2 鼠傷寒沙門氏菌菌懸液的制備

從-80℃冰箱中取出鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028，在溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)固體平板培養(yǎng)基上劃線，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20h；挑取單菌落置于LB液體試管培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng).將培養(yǎng)后的菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新的LB液體試管培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(A600＝0.6～1)后，取部分菌液置于離心管中，4℃、10000r/min離心30s，棄去上清液后加入相同體積的無(wú)菌生理鹽水重新懸浮，再次離心，重復(fù)兩次以洗去培養(yǎng)基；再用生理鹽水懸浮細(xì)菌，使菌體濃度為1.0×107mL-1(菌體濃度用平板計(jì)數(shù)確定)[21].

1.2.3 飼料的配方與制備方法

小鼠飼料配方見(jiàn)表1.

表1 小鼠飼料配方 Tab.1 Mouse feed formula

飼料制備時(shí)，按照表1稱量好所有物料并混合，將預(yù)先制備好的食品級(jí)明膠水溶液(40g明膠在800mL常溫水中浸泡3～4h，70℃水浴30min使其充分溶解)加到1000g飼料中攪拌，和成飼料面團(tuán).將和好的飼料面團(tuán)搓成長(zhǎng)度約為4～6cm、直徑約為1cm的圓柱，放入烘箱60℃烘干.

1.2.4 小鼠飼料成分含量的測(cè)定

淀粉含量參照GB 5009.9—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》中的酸水解法進(jìn)行測(cè)定.脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定.蛋白質(zhì)含量參照SN/T 3926—2014《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)法》進(jìn)行測(cè)定.膳食纖維含量參照GB 5009.88—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定.

黃酮含量的測(cè)定[23]：以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法在510nm下檢測(cè)吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程.將待測(cè)樣品溶于20倍體積的80%乙醇溶液中，60℃水浴冷凝回流90min，超聲提取20min，過(guò)濾；濾渣繼續(xù)用80%乙醇溶液超聲提取1次，記錄濾液的總體積.取適量濾液，12000r/min離心10min，留上清液為樣品溶液備用.吸取樣品溶液2mL置于10mL容量瓶中，后續(xù)按照標(biāo)準(zhǔn)溶液的步驟操作，在510nm下檢測(cè)吸光度.

1.2.5 生理生化指標(biāo)的測(cè)定方法

鼠傷寒沙門氏菌涂板計(jì)數(shù)：取0.1g新鮮糞便用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍，研磨制成均勻的菌懸液，取適量涂布于預(yù)先制好的沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便中鼠傷寒沙門氏菌的菌數(shù)(N).分別檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌侵染第3天與第6天的糞便樣本.

糞便黃酮含量的測(cè)定：參照1.2.4節(jié)中的方法進(jìn)行測(cè)定.分別檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌未侵染與侵染第6天的糞便樣本.

結(jié)腸長(zhǎng)度：在鼠傷寒沙門氏菌侵染結(jié)束后，解剖小鼠取結(jié)腸，并對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量與記錄.

小鼠血清炎癥因子濃度的測(cè)定：使用ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10的質(zhì)量濃度，操作時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明的步驟進(jìn)行.其 中，血清在鼠傷寒沙門氏菌侵染結(jié)束后取得，為侵染第6天的樣本.

腸道切片：腸道組織樣本使用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin and eosin staining，HE)染色，即取3mm厚的組織樣本進(jìn)行脫水、石蠟包埋，取4μm厚的切片在HE染色后進(jìn)行全景掃描.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7.04進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)用于計(jì)算各因素之間的相關(guān)關(guān)系，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆豆粕與赤小豆飼料成分含量的對(duì)比

小鼠飼料中膳食成分的含量對(duì)比見(jiàn)表2.由表2可以看出：4種飼料中的主要膳食成分(淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)與膳食纖維)含量之間沒(méi)有顯著性差異；在黃酮含量上，ST飼料與SBM飼料之間沒(méi)有顯著性差異，而RB飼料的黃酮含量顯著高于ST與SBM飼料的.

表2 小鼠飼料中膳食成分的含量對(duì)比 Tab.2 Comparison of dietary components in the feed of mice

2.2 小鼠生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 小鼠飼養(yǎng)與灌胃侵染期間的體質(zhì)量

在人們的日常飲食中，對(duì)雞蛋、牛奶、豬肉、雞肉、牛肉等食品的攝入是最為常見(jiàn)的，而這些都屬于動(dòng)物性食品。因此，加強(qiáng)動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫工作，減少動(dòng)物性食品安全問(wèn)題的發(fā)生，對(duì)保障人們的健康和國(guó)家的穩(wěn)固發(fā)展具有重大意義[1]。

適應(yīng)期與膳食干預(yù)期的小鼠體質(zhì)量如圖1所示.

圖1 適應(yīng)期與膳食干預(yù)期的小鼠體質(zhì)量 Fig.1 Body weight of mice at the adaptive stage and the dietary intervention stage

從圖1中可以看出：在前5周的適應(yīng)與膳食干預(yù)期間，5組小鼠的體質(zhì)量都呈上升趨勢(shì)，組間無(wú)顯著性差異.由表2可知：4種飼料的主要膳食成分大體一致，只有黃酮含量存在差異，說(shuō)明黃酮含量的差異并未明顯影響小鼠的體質(zhì)量.

鼠傷寒沙門氏菌侵染期間的小鼠體質(zhì)量如圖2所示.從圖2中可以看出：在灌胃期間，由于鼠傷寒沙門氏菌侵染小鼠腸道，所有鼠傷寒沙門氏菌侵染組小鼠的體質(zhì)量均顯著下降，SBMI組小鼠的體質(zhì)量最先降低；由于赤小豆中含有可以抵抗鼠傷寒沙門氏菌的功能成分[24]，使得RBI組小鼠的體質(zhì)量在侵染初期維持平穩(wěn)了一段時(shí)間，體質(zhì)量損失發(fā)生的時(shí)間最晚.在侵染后期，由于小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌的積累，使其不適反應(yīng)更加強(qiáng)烈，活動(dòng)緩慢，進(jìn)食減少，使小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)下降趨勢(shì).因此可以推測(cè)，在鼠傷寒沙門氏菌侵染期間，攝入適量的赤小豆可以有助于短暫維持小鼠體質(zhì)量，減緩侵染引起的不良反應(yīng).

圖2 鼠傷寒沙門氏菌侵染期間的小鼠體質(zhì)量 Fig.2 Body weight of mice during S.Typhimurium infection

2.2.2 小鼠存活率

小鼠在受到鼠傷寒沙門氏菌侵染后，起初表現(xiàn)為進(jìn)食量減少、行動(dòng)遲緩及毛發(fā)失去光澤等癥狀；隨著侵染次數(shù)的增加，小鼠會(huì)出現(xiàn)身體蜷縮、顫抖、腹瀉甚至死亡等較為嚴(yán)重的癥狀.鼠傷寒沙門氏菌侵染期間小鼠的存活率如圖3所示.從圖3中可以看出：侵染結(jié)束，ST組沒(méi)有發(fā)生死亡，STI組、SBMI組、10%RBI組死亡率均為50%，而5%RBI組存活率為75%，明顯高于其他侵染組.這說(shuō)明5%的赤小豆攝入在鼠傷寒沙門氏菌持續(xù)侵染過(guò)程中可以緩解小鼠的死亡情況.

圖3 鼠傷寒沙門氏菌侵染期間小鼠的存活率 Fig.3 Survival of mice during S.Typhimurium infection

2.2.3 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度

從圖4中可以看出：未受侵染的ST組小鼠的結(jié)腸最長(zhǎng)，受侵染小鼠的結(jié)腸均較短；從均值來(lái)看，SBMI組與5%RBI組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度可以達(dá)到與ST組的相近的狀態(tài)，而STI組與10%RBI組小鼠的結(jié)腸均較短.但是，由于小鼠之間差異較大，誤差較高，使得不同組之間在結(jié)腸長(zhǎng)度上沒(méi)有顯著性差異.

圖4 小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度 Fig.4 Colon length of mice

2.2.4 小鼠糞便鼠傷寒沙門氏菌涂板計(jì)數(shù)結(jié)果

灌胃期間，由于對(duì)小鼠進(jìn)行了鼠傷寒沙門氏菌的侵染，該菌在小鼠腸道中定殖，使得糞便中也存在該菌.使用小鼠糞便進(jìn)行平板涂布，侵染第3天和第6天小鼠糞便的鼠傷寒沙門氏菌涂板計(jì)數(shù)結(jié)果如圖5所示.

圖5 侵染第3天和第6天小鼠糞便的鼠傷寒沙門氏菌涂板計(jì)數(shù) Fig.5 Count of S.Typhimurium in feces of mice on day 3 and 6 after infection

由圖5可以看出：與第3天相比，隨著灌胃時(shí)間的增加，小鼠糞便中鼠傷寒沙門氏菌的含量在第6天明顯增加，發(fā)生了數(shù)量級(jí)變化，而且STI組的鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量均顯著高于其他3組，說(shuō)明STI組抵抗鼠傷寒沙門氏菌侵染能力最弱.在第6天，5%RBI組的菌含量顯著低于其他3組，說(shuō)明改善結(jié)腸炎的作用可能與減少鼠傷寒沙門氏菌在小鼠腸道中的定殖有關(guān).而與STI組相比，10%RBI組雖然也表現(xiàn)出較少的鼠傷寒沙門氏菌定殖，但還是顯著高于5%RBI組.結(jié)果表明，大豆和赤小豆的攝入均可以改善鼠傷寒沙門氏菌在小鼠腸道中的定殖，而5%赤小豆的攝入產(chǎn)生了更好的抑制效果.因此可以推測(cè)，適當(dāng)?shù)某嘈《箶z入可以幫助小鼠抵御鼠傷寒沙門氏菌的侵染，但并不是越多越好.

2.2.5 小鼠糞便中總黃酮含量

研究[28]表明，黃酮類化合物具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等作用.侵染前后小鼠糞便中的總黃酮含量如圖6所示.

圖6 侵染前后小鼠糞便中的總黃酮含量 Fig.6 Total flavonoid content in feces of mice before and after infection

從表2可以看出，ST飼料和SBM飼料中的黃酮含量極少，幾乎沒(méi)有，而5%RB飼料中的黃酮含量是前兩者的7倍，10%RB飼料中的黃酮含量是前兩者的14倍.由圖6可知：RBI組的黃酮含量遠(yuǎn)高于其他組，STI組與SBMI組在侵染前沒(méi)有明顯的差異，而侵染后，SBMI組的黃酮含量顯著低于STI組，且在侵染后5%RBI組的黃酮含量明顯升高，10%RBI組卻顯著下降.因此，RB飼料對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用可能主要與黃酮的存在有關(guān).有研究[29-30]表明，嚴(yán)重的沙門氏菌侵染會(huì)使宿主體內(nèi)總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的含量降低，這可能導(dǎo)致宿主處于嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)，腸道內(nèi)的黃酮類化合物更容易被氧化分解.鼠傷寒沙門氏菌侵染后引起的腸道炎癥，可能導(dǎo)致宿主吸收效率降低，從而表現(xiàn)為糞便中的黃酮含量升高.因此，糞便中的黃酮含量較侵染前升高或降低會(huì)受炎癥程度的影響.SBMI組侵染前后，糞便中的黃酮含量無(wú)顯著性差異，始終處于較低水平，但整體表現(xiàn)為降低的趨勢(shì)，與10%RBI組表現(xiàn)類似.這可能是由于鼠傷寒沙門氏菌侵染導(dǎo)致小鼠腸道處于高氧化環(huán)境，使黃酮發(fā)生嚴(yán)重氧化，含量明顯降低.而5%RBI組侵染前糞便中的黃酮含量與STI組之間無(wú)顯著性差異，但5%RB飼料中的黃酮含量顯著高于ST組和SBMI組，證明5%RB飼料中的黃酮大部分被小鼠吸收，而侵染后輕微的腸道炎癥可能導(dǎo)致宿主吸收效率降低，從而表現(xiàn)出糞便中的黃酮含量升高.

從表2、圖5和圖6中可以看出：STI組與SBMI組由于其飼料中黃酮含量極低，黃酮在小鼠體內(nèi)積累量減少，糞便檢出量也較少；當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌侵染時(shí)，細(xì)菌正常定殖，數(shù)量增多，糞便中檢出的鼠傷寒沙門氏菌濃度較高.相反，RBI組小鼠在一個(gè)月的膳食干預(yù)期攝入了較多的黃酮，幫助調(diào)節(jié)腸道，因此當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌侵染時(shí)，它可以幫助抵抗致病菌的侵害，糞便中的黃酮含量和鼠傷寒沙門氏菌計(jì)數(shù)恰好印證了這一點(diǎn).然而，與5%RB飼料相比，10%RB飼料含有更高含量的黃酮，糞便中的黃酮含量也較高，但喂食10%RB飼料的小鼠并沒(méi)有比喂食5%RB飼料的小鼠更能抵抗鼠傷寒沙門氏菌的侵染，反而糞便中鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量更高.這可能是由于高含量的黃酮類化合物并沒(méi)有讓小鼠全部吸收，在侵染期間腸道的高氧化環(huán)境反而使其氧化損失.因此，攝入適量的黃酮可以更好地抵抗鼠傷寒沙門氏菌的侵染，但并不是越多越好，這進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的推斷.

為了進(jìn)一步了解疾病相關(guān)指標(biāo)(死亡率、鼠傷寒沙門氏菌含量和體質(zhì)量)與飼料膳食成分(淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、膳食纖維和黃酮)之間的相關(guān)性，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)(相關(guān)系數(shù)為1，表示完全正相關(guān)；相關(guān)系數(shù)為－1，表示完全負(fù)相關(guān)；相關(guān)系數(shù)越接近于0，表示相關(guān)性越弱；相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值越大，表示相關(guān)性越強(qiáng)).Pearson相關(guān)系數(shù)結(jié)果如圖7所示.

圖7 皮爾遜相關(guān)系數(shù) Fig.7 Pearson correlation coefficient

從圖7可以看出：黃酮含量與死亡率、鼠傷寒沙門氏菌含量、體質(zhì)量均為負(fù)相關(guān)，其中與鼠傷寒沙門氏菌含量和死亡率的相關(guān)性較強(qiáng)，與體質(zhì)量的相關(guān)性相對(duì)較弱；膳食纖維含量與鼠傷寒沙門氏菌含量為負(fù)相關(guān)；淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)與小鼠其他疾病表現(xiàn)均為弱相關(guān).這說(shuō)明飼料中的黃酮類化合物可能幫助小鼠抵抗鼠傷寒沙門氏菌的侵染，減少死亡.

當(dāng)然，赤小豆飼料對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用也并不能完全歸因于黃酮的存在，一些其他的微量物質(zhì)也可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響.例如錳[31]、鋅[32]、鐵[33]等微量元素作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素也可能在一定程度上影響致病菌侵染的進(jìn)程，還有豆類中的皂苷、膳食纖維等物質(zhì)也具有一定的抗菌活性[34-35].從圖7中也可以看出，膳食纖維含量與鼠傷寒沙門氏菌含量呈負(fù)相關(guān).

2.2.6 腸道切片

由于鼠傷寒沙門氏菌的侵染，細(xì)菌在腸道中定 殖，參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，破壞腸道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞.對(duì)各組小鼠的結(jié)腸進(jìn)行切片染色，觀察其腸道形態(tài)，如圖8所示.與ST組相比，STI組經(jīng)鼠傷寒沙門氏菌侵染后絨毛結(jié)構(gòu)松散，脫離腸壁，結(jié)腸內(nèi)部無(wú)完整形態(tài)；而經(jīng)過(guò)大豆豆粕和赤小豆膳食補(bǔ)充的小鼠基本保持著腸道完整性，絨毛排列相對(duì)整齊，腸壁無(wú)明顯的損傷，其中5%RBI組小鼠的腸道內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)最為完整，更接近于ST組.這進(jìn)一步驗(yàn)證了大豆豆粕與赤小豆的膳食干預(yù)明顯緩解了小鼠的腸道炎癥，幫助小鼠維持腸屏障的完整性，減輕鼠傷寒沙門氏菌侵染導(dǎo)致的腸道損傷.

圖8 小鼠結(jié)腸切片 Fig.8 Colon section of mouse

2.2.7 小鼠血清中炎癥因子的濃度

腸道在受到嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)會(huì)釋放大量的TNF-α、IL-1β等促炎因子和IL-10等抗炎因子，小鼠血清中炎癥因子的濃度可以反映小鼠腸道受損傷的嚴(yán)重程度[36-38].TNF-α在免疫反應(yīng)中既可以作為促炎介質(zhì)，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，又可以作為免疫抑制介質(zhì)，抑制自身免疫性疾病的發(fā)展和腫瘤的發(fā)生，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[39].IL-1家族有4種拮抗因子與7種促炎因子，IL-1β作為促炎因子之一可以調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)損傷[40].IL-10是一種作用廣泛的抗炎細(xì)胞因子，可以抑制單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等.小鼠血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度如圖9所示.

從圖9(a)和圖9(b)可以看出：ST組小鼠未受侵 染，因此TNF-α和IL-1β的含量都極低，而STI組的含量均最高，這說(shuō)明STI組的小鼠炎癥最嚴(yán)重，鼠傷寒沙門氏菌的侵染使其產(chǎn)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；SBMI組、5%RBI組與ST組小鼠的情況近似，說(shuō)明大豆豆粕和赤小豆中的成分發(fā)揮了一定的作用，減輕了鼠傷寒沙門氏菌引起的炎癥反應(yīng).IL-10作為抗炎因子，其含量越高則體內(nèi)炎癥越輕，由圖9(c)可以看出其含量趨勢(shì)與前兩個(gè)促炎因子相反.這進(jìn)一步驗(yàn)證了相比于ST飼料，SBM飼料與5%RB飼料更好地緩解了鼠傷寒沙門氏菌引起的腸道炎癥反應(yīng).此外，從圖9(b)和(c)還可以看出，5%RBI組的TNFα顯著低于SBMI組的，而IL-10濃度顯著高于SBMI組的，說(shuō)明5%RB飼料不僅可以緩解鼠傷寒沙門氏菌引起的腸炎，還達(dá)到了比SBM飼料更好的效果.

圖9 小鼠血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度 Fig.9 Concentration of inflammatory factors in mouse serum

黃酮類化合物可以在體內(nèi)外不同程度地抑制腸道炎癥.槲皮素是一種常見(jiàn)的抗氧化劑類黃酮，在體外能夠下調(diào)骨髓源性巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)，同時(shí)可以通過(guò)抑制NF-κB通路調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎[41].黃芩純化物可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中NF-κB的激活，發(fā)揮抗炎作用[42].大豆異黃酮可以顯著抑制雌激素受體α和NLRP3炎癥小體的表達(dá)，改善DSS誘導(dǎo)的腸道炎癥[43].根據(jù)以上研究推測(cè)，黃酮類化合物在緩解鼠傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)的腸道炎癥中發(fā)揮了重要作用.當(dāng)然，赤小豆飼料對(duì)腸道炎癥的抑制作用也并不能完全歸因于黃酮的存在，一些豆類中的其他微量物質(zhì)也可能會(huì)對(duì)腸道炎癥產(chǎn)生影響，例如膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸等[44－46].

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用由鼠傷寒沙門氏菌侵染小鼠引起的腸道炎癥模型探究了大豆豆粕及赤小豆對(duì)腸道炎癥的影響，通過(guò)測(cè)定飼料成分中的膳食成分和黃酮含量、糞便中的鼠傷寒沙門氏菌含量、糞便中的黃酮含量、小鼠血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度并對(duì)腸道切片觀察，分析膳食干預(yù)對(duì)小鼠腸道炎癥的改善作用.結(jié)果表明，當(dāng)受到致病菌如鼠傷寒沙門氏菌侵染時(shí)，豆類中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能成分會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，削弱致病菌的侵染能力，減輕腸道炎癥等不良影響.赤小豆減弱鼠傷寒沙門氏菌的侵染作用可能是包括膳食纖維在內(nèi)的多種物質(zhì)復(fù)合作用的結(jié)果，但其中的黃酮發(fā)揮了重要作用，適量攝入黃酮類化合物有助于抑制腸道致病菌的侵染.