運動預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷老齡大鼠心肌細胞自噬和凋亡的影響

李宏玉，尹 俠，王艷霞，李宇婷，朱路文，唐 強

1黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150070

缺血性心臟病具有高發(fā)病率、高致死率的特點。發(fā)病人群主要以中老年人為主，但近年來患病人群呈逐漸年輕化趨勢。臨床治療大多以藥物治療或介入手術(shù)治療以開通狹窄或被堵塞的心血管，保證血液供應(yīng)的通暢。但對缺血心肌組織進行復(fù)灌治療后，會出現(xiàn)心肌損傷程度進一步加重，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）［1-2］。自噬是心肌缺血和再灌注的顯著特征，參與了MIRI的病理過程，研究發(fā)現(xiàn)再灌注過程中過度自噬會造成心肌細胞自噬性凋亡，從而加重心肌組織損傷［3-4］。此外，隨著心肌衰老，心肌細胞處于缺氧狀態(tài)，會產(chǎn)生大量氧自由基，心肌會受到不同程度的損傷，從而導(dǎo)致細胞凋亡［5-6］。自噬對MIRI有“雙刃劍”作用，一方面自噬可以降解應(yīng)激狀態(tài)下氧化自由基，同時防止異常蛋白質(zhì)的聚集；另一方面，自噬的過度活躍會造成自噬應(yīng)激，損傷細胞器，對細胞有損害。因此，如何調(diào)控自噬程度是發(fā)揮“雙刃劍”作用的核心。

缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IPC）是迄今為止最有效的內(nèi)源性心肌缺血保護方法［7］。運動預(yù)適應(yīng)（exercise preconditioning，EP）是缺血預(yù)適應(yīng)的一種，通過短時間內(nèi)反復(fù)間歇性大強度的有氧運動訓(xùn)練，激發(fā)機體免疫系統(tǒng)應(yīng)激機制，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性保護物質(zhì)，提高心肌對缺氧、缺血損傷的耐受能力，從而對機體心肌起保護作用，在臨床疾病預(yù)防中應(yīng)用可行性較強。研究顯示，通過運動預(yù)處理誘導(dǎo)細胞自噬和凋亡，進而啟動下游事件發(fā)揮老齡心肌IPC保護作用［8-9］。但其具體作用機制尚不完全清楚。本研究將在離體心臟灌流模型上，通過抑制自噬，觀察運動預(yù)處理對老齡大鼠IPC心肌細胞自噬、凋亡的影響，探討其可能的作用機制，這也許可以為老齡心肌MIRI的防治提供一種新思路、新靶點和新的干預(yù)方法。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性Sprague-Dawley老齡大鼠80只，鼠齡15～18個月，體質(zhì)量（450±20）g，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心［動物使用許可證號：SYXK（黑）2019002］。飼養(yǎng)環(huán)境：通風良好，自由飲水，人工光照12 h/12 h明暗交替、溫度（21±2）℃，濕度（60±5）%的標準屏障環(huán)境。

1.2 主要儀器與試劑

ZH-PT型動物實驗跑臺（徐州利華電子公司）；Langendorff離體心臟灌流實驗系統(tǒng)（江蘇賽昂斯生物技術(shù)有限公司）；-80℃超低溫冰箱（日本Panasonic公司）；DAB顯色液（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Tween 20（北京博奧拓達科技有限公司）；內(nèi)參GAPDH（美國Affinity公司）；山羊抗兔IgG-HRP（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；肝素鈉注射液（天津生物化學制藥有限公司，規(guī)格1萬U/mL）；自噬抑制劑組3-甲基腺嘌呤（美國Abmole公司）；KH液配置試劑（氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、葡萄糖、氯化鈣、硫酸鎂）均購于天津市風船化學試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物篩選及分組

采用電動動物跑臺進行訓(xùn)練，1次/d，共訓(xùn)練3 d。跑臺參數(shù)如下：①時間30 min/d；②速度15 m/min；③坡度0°；④電擊強度1.0 mA。淘汰標準：1次訓(xùn)練中電擊次數(shù)＞5和/或1次電擊時間＞1 s的大鼠。淘汰不配合或體質(zhì)虛弱不符合實驗標準的大鼠8只，納入60只入組大鼠進行體質(zhì)量測定，其余12只作為補充組備用。按照隨機數(shù)字表法分為對照組（Con組）、缺血再灌注模型組（IR組）、運動預(yù)處理＋缺血預(yù)適應(yīng)組（EP＋IPC組）、運動預(yù)處理＋缺血預(yù)適應(yīng)＋生理鹽水組（EP＋IPC＋saline組）、運動預(yù)處理＋缺血預(yù)適應(yīng)＋自噬抑制劑組（EP＋IPC＋3-MA組），每組12只。

2.2 干預(yù)方法

Con組、IR組不做特殊運動干預(yù)；EP＋IPC組、EP＋IPC＋saline組和EP＋IPC＋3-MA組接受運動預(yù)處理干預(yù)，具體如下：采用電動動物實驗跑臺進行梯度運動訓(xùn)練，1次/d，5 d/周，共訓(xùn)練6周。跑臺參數(shù)如下：①起始時間15 min/d，每3 d增加5 min，直至時間增至60 min/d后不再變化；②速度20 m/min；③坡度0°；④電擊強度1.0 mA。

2.3 模型制備

術(shù)前麻醉選取1%戊巴比妥鈉溶液經(jīng)大鼠腹腔注射（40～50 mg/kg），為防止血管凝血，按1000 U/kg劑量腹腔注射10%肝素鈉生理鹽水。固定、開胸、迅速取出心臟，用1號線將離體心臟固定在Langendorff離體灌流裝置上，使心臟接受95%O2和5%CO2KH液（37℃）恒溫恒壓灌流。在模型制備過程中EP＋IPC＋3-MA組和IR組分別有4只和2只大鼠在再灌注后心臟復(fù)跳失敗，選取補充組大鼠進行了補充。補充大鼠的干預(yù)方法分別同EP＋IPC＋3-MA組和IR組。

2.3.1 Con組 當心臟離體之后，快速進行主動脈插管進行離體灌流，持續(xù)平衡灌注180 min，不參與缺血處置［9-10］。

2.3.2 IR組 預(yù)灌注平衡20 min，然后保持心臟溫度恒定在37℃，通過控制灌流設(shè)備的三通閥，使全心缺血40 min后，再復(fù)灌120 min。

2.3.3 EP＋IPC組 EP＋IPC組大鼠心臟離體后平衡灌注20 min后，給予3次缺血預(yù)處理（短暫缺血5 min，再灌注10 min），之后缺血40 min，再復(fù)灌120 min。

2.3.4 EP＋IPC＋saline組 復(fù)制EP＋IPC組操作，在缺血預(yù)適應(yīng)處理的過程中給予生理鹽水，劑量為3.0 mg/200 g。

2.3.5 EP＋IPC＋3-MA組 復(fù)制EP＋IPC操作，在缺血預(yù)適應(yīng)處理的過程中給予3-MA，劑量為3.0 mg/200 g［11］。

2.4 觀察指標

2.4.1 透射電鏡觀察心肌細胞自噬體 灌流結(jié)束后迅速取下離體心臟，在心尖處切除1 cm×1 cm×1 cm大小心肌組織進行切塊、研磨、離心，取上清液加入2.5%戊二醛固定液2～4 h后用PBS溶液反復(fù)清洗，加入1%鋨酸固定1～2 h后用PBS溶液反復(fù)清洗，用酒精進行梯度脫水后，進行20 min純丙酮處理，后加入包埋劑丙酮混合液（3∶1）處理3 h，最后加入純包埋劑丙酮混合液過夜。組織切片（50～70 nm），用醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液對切片進行反復(fù)沖洗。用檸檬酸鉛對切片染色15 min，利用透射電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)情況，拍攝照片進行記錄與分析結(jié)果。

2.4.2 TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡情況 將離體心臟灌流結(jié)束后，取心肌組織固定于4%多聚甲醛中2 h后用15%蔗糖脫水，次日依次進行水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（5μm）、貼片。按照TUNEL試劑盒說明進行操作，在熒光顯微鏡下隨機選取標本中5個非重疊400倍鏡視野，Image-Pro Plus 6.0軟件計數(shù)凋亡細胞。TUNEL染色陽性的凋亡細胞顯棕色。

心肌細胞凋亡指數(shù)＝凋亡心肌細胞數(shù)/心肌細胞總數(shù)×100%

2.4.3 Western blot檢測Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bax、Caspase-9、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達水平 在灌注結(jié)束后，取下離體心臟放入液氮內(nèi)速凍后置于-80℃冰箱保存，各組取一定量的心肌組織裂解后，提取上清蛋白液進行蛋白定量。制備上樣液、根據(jù)各蛋白的分子量配置相應(yīng)濃度的分離膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗過夜、次日孵育二抗、顯色、凝膠系統(tǒng)拍照成像、計算各蛋白與內(nèi)參的灰度值。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD-t檢驗，不齊者則用Tamhane's T2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 5組大鼠心肌細胞自噬體透射電鏡觀察結(jié)果

Con組觀察到少量自噬溶酶體；IR組觀察到較多自噬溶酶體及自噬小泡；EP＋IPC組觀察到少量自噬溶酶體；EP＋IPC＋saline組觀察到少量自噬小泡；EP＋IPC＋3-MA組未觀察到典型的自噬小泡及自噬溶酶體。見圖1。

3.2 TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡情況

Con組見極少數(shù)TUNEL陽性細胞。與Con組比較，IR組TUNEL陽性細胞比值明顯升高（P＜0.05）；與IR組比較，EP＋IPC、EP＋IPC＋saline組TUNEL陽性細胞比值明顯降低（P＜0.05）；與EP＋IPC、EP＋IPC＋saline組比較，EP＋IPC＋3-MA組TUNEL陽性細胞比值明顯升高（P＜0.05）。見表1、圖2。

圖1 5組心肌細胞自噬體透射電鏡觀察結(jié)果（×10 000）Figure 1 Transmission electron microscopy results of autophagosomes of cardiomyocytes in five groups(×10 000)

表1 5組大鼠TUNEL心肌細胞凋亡指數(shù)（±s） %Table 1 Ratios of TUNEL cardiomyocyte apoptosis index in five groups（±s） %

表1 5組大鼠TUNEL心肌細胞凋亡指數(shù)（±s） %Table 1 Ratios of TUNEL cardiomyocyte apoptosis index in five groups（±s） %

注：與Con組比較，1）P＜0.05；與IR組比較，2）P＜0.05；與EP＋IPC組比較，3）P＜0.05；與EP＋IPC＋saline組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;compared with the IR group,2)P＜0.05;compared with the EP+IPC group,3)P＜0.05;compared with the EP+IPC+saline group,4)P＜0.05.

組別Con組IR組EP+IPC組EP+IPC+saline組EP+IPC+3-MA組n 12 12 12 12 12 TUNEL陽性細胞比值6.44±0.46 39.23±1.321）25.68±1.082）26.53±2.032）36.78±1.173）4）

3.3 5組大鼠心肌蛋白表達結(jié)果

與Con組比較，IR組Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bax、Caspase-9蛋白表達均明顯升高，Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。與IR組比較，EP＋IPC、EP＋IPC＋saline組Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bax、Caspase-9蛋白表達均明顯降低，Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）；EP＋IPC＋3-MA組Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與EP＋IPC、EP＋IPC＋saline組比較，EP＋IPC＋3-MA組Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達均明顯降低，Bax、Caspase-9蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）。見表2、圖3。

圖2 5組大鼠心肌TUNEL凋亡染色圖（×400）Figure 2 TUNEL staining images of myocardial TUNEL apoptosis in five groups(×400)

表2 5組大鼠心肌蛋白表達比較（±s）Table 2 Comparison of expression of proteins in the myocardium in five groups（±s）

表2 5組大鼠心肌蛋白表達比較（±s）Table 2 Comparison of expression of proteins in the myocardium in five groups（±s）

注：與Con組比較，1）P＜0.05；與IR組比較，2）P＜0.05；與EP＋IPC組比較，3）P＜0.05；與EP＋IPC＋saline組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;compared with the IR group,2)P＜0.05;compared with the EP+IPCgroup,3)P＜0.05;compared with the EP+IPC+saline group,4)P＜0.05.

組別Con組IR組EP+IPC組EP+IPC+saline組EP+IPC+3-MA組n 12 12 12 12 12 Beclin-1 0.27±0.49 0.70±0.481）0.51±0.152）0.47±0.382）0.26±0.092）3）4）LC3-Ⅱ0.54±0.08 1.34±0.061）0.89±0.112）1.01±0.162）0.58±0.382）3）4）Bax 0.25±0.03 0.52±0.051）0.35±0.032）0.36±0.062）0.52±0.043）4）組別Con組IR組EP+IPC組EP+IPC+saline組EP+IPC+3-MA組n 12 12 12 12 12 Caspase-9 0.14±0.02 0.51±0.011）0.33±0.042）0.37±0.012）0.53±0.023）4）Bcl-2 0.41±0.01 0.27±0.011）0.42±0.012）0.41±0.022）0.26±0.013）4）Bcl-XL 0.92±0.08 0.46±0.011）0.88±0.092）0.85±0.072）0.44±0.033）4）

圖3 5組心肌蛋白表達圖Figure 3 Protein expression of myocardial in five groups

4 討 論

4.1 運動預(yù)處理可調(diào)控MIRI老齡大鼠心肌細胞自噬的適度表達

本研究通過制備離體MIRI模型，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，IR組心肌細胞存在較多自噬溶酶體及自噬小泡，這提示缺血再灌注的過程會導(dǎo)致心肌細胞缺血、缺氧，加重心肌細胞損傷。缺血再灌注前給予一定量的運動訓(xùn)練，同時給予缺血預(yù)適應(yīng)，心肌細胞中發(fā)現(xiàn)少量自噬溶酶體及自噬小泡。此外，引入自噬抑制劑3-MA作為對照，電鏡檢查結(jié)果顯示，與EP＋IPC組比較，EP＋IPC＋3-MA組未觀察到典型的自噬小泡及自噬溶酶體，這提示3-MA抑制了運動訓(xùn)練誘導(dǎo)的IPC的心肌保護效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注啟動了心肌細胞的自噬。缺血前給予一定量的運動訓(xùn)練，心肌細胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達降低，這提示運動訓(xùn)練抑制了心肌細胞自噬的啟動以及發(fā)生、發(fā)展，而給予3-MA干預(yù)后，運動訓(xùn)練后IPC明顯減輕老齡心肌細胞自噬程度。因此本研究推測運動預(yù)處理干預(yù)對MIRI產(chǎn)生保護效應(yīng)可能與自噬和凋亡相關(guān)。

自噬是細胞中普遍存在的生理過程。在誘導(dǎo)自噬的途徑中，Beclin-1是自噬起始的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是判斷自噬發(fā)生發(fā)展的金指標［12-13］，一旦Beclin-1表達上升則促進自噬，而過度自噬則會誘發(fā)細胞凋亡。LC3也是反映自噬激活的重要標志之一，LC3-Ⅱ在自噬激活后形成，位于自噬體膜的內(nèi)外表面，是特異表達于自噬小體膜的分子標志。正常情況下，心肌細胞自噬一般維持在較低的水平，當發(fā)生缺血、低氧，細胞老化等，自噬水平則會顯著上調(diào)［14-16］。運動作為一種生理壓力、多次反復(fù)的外界刺激，可引起心肌細胞的應(yīng)激反應(yīng)從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。適宜強度的運動鍛煉可通過增強自噬活性促進心肌細胞降解代謝廢物，以維持其自身穩(wěn)定狀態(tài)［17］。這與研究顯示運動預(yù)處理可以調(diào)節(jié)細胞自噬，通過自噬途徑促進細胞存活及改善組織的病理形態(tài)，發(fā)揮保護效應(yīng)的結(jié)果一致［18-19］。

4.2 運動預(yù)處理可減輕MIRI老齡大鼠的細胞凋亡情況

本研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注后，細胞凋亡程序啟動，促凋亡的Bax、Caspase-9蛋白表達升高，抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達降低。而給予一定強度的運動訓(xùn)練后，心肌組織中Bax、Caspase-9蛋白表達降低，Bcl-2、Bcl-XL表達升高，這提示在心肌缺血再灌注前進行適度運動訓(xùn)練能夠增加老齡大鼠心肌的耐受性，減輕缺血心肌細胞凋亡。與EP＋IPC組比較，EP＋IPC＋3-MA組心肌細胞中抑凋亡因子Bcl-2、Bcl-XL表達明顯降低，促凋亡因子Bax、Caspase-9蛋白表達明顯升高。這提示EP產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)的重要機制之一可能與其調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡相關(guān)基因的表達有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血及缺血再灌注過程中心肌細胞可能出現(xiàn)凋亡和壞死［20-21］。在凋亡過程中，Bcl-2家族起重要作用，Bcl-2為抗凋亡基因，Bax為促凋亡基因，兩者平衡影響凋亡的發(fā)生。再灌注過程會抑制Bcl-2蛋白表達，同時升高Bax蛋白表達。Caspases家族成員中的Caspase-9被認為是啟動死亡蛋白酶，可以直接使細胞發(fā)生凋亡。EP能夠通過上調(diào)與細胞保護相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)，減輕細胞凋亡情況從而減輕心肌缺血再灌注損傷［22-23］。這與胡陽等［24-25］研究結(jié)果基本一致。

5 小 結(jié)

運動預(yù)處理可誘導(dǎo)老齡大鼠心肌IPC保護作用，能夠減輕心肌缺血/再灌注損傷時心肌細胞凋亡，改善心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。其機制可能與運動調(diào)節(jié)老齡大鼠心肌細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達，誘導(dǎo)自噬適度發(fā)生有關(guān)，同時還與促進Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達，抑制Bax、Caspase-9蛋白表達有關(guān)。但本研究存在一些不足，如對參與調(diào)控自噬機制的相關(guān)信號通路及各通路間的相互作用尚不明確，還有待于下一步繼續(xù)研究。