黃姑魚NK-lysin基因的克隆及表達(dá)分析

吳寶蘭，羅 帥，韓 芳，王志勇

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

0 引言

NK-lysin是一種由細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicT-lymphocytes,CLT)和自然殺傷淋巴細(xì)胞(naturalkillerlymphocytes,NKL)分泌的抗菌肽，屬于鞘脂激活蛋白樣蛋白(saposin-like protein)家族[1]。越來越多的魚類NK-lysin被研究，如：王改玲等[2]通過原核表達(dá)純化出了草魚(Ctenopharyngodonidella)的NK-lysin可溶性融合蛋白，并證明了該重組蛋白對(duì)部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有抑菌活性；許巧情等[3]在真核畢赤酵母體系中表達(dá)了黃鱔(Monopterusalbus)的NK-lysin蛋白，并表明對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和維氏氣單胞菌(Aeromonasvertebrosa)具有明顯抑制作用；半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)的NK-lysin蛋白具有調(diào)節(jié)免疫、抑制細(xì)菌和病毒增長的功能[4];人工合成的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)NK-lysin蛋白具有較強(qiáng)的抗寄生蟲活性[5]。大量研究證明，NK-lysin具有較強(qiáng)的殺菌[6]、抗病毒[7]和抗寄生蟲作用[8]，在魚類抵抗病原體感染的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

黃姑魚(Nibeaalbiflora)是一種重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類，主要分布于我國沿海[9]。由弧菌引起的黃姑魚細(xì)菌性疾病日趨嚴(yán)重，其病原菌主要包括哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)[10]、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)[11]和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)[12]等。長期以來主要使用抗生素預(yù)防和治療魚類疾病，導(dǎo)致藥物殘留和耐藥性細(xì)菌滋生等問題越來越嚴(yán)重。NK-lysin等抗菌肽具有分子量小、抗菌譜廣和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種新型高效的抗菌藥物。研究NK-lysin等抗菌肽有助于探明魚類的免疫功能，對(duì)開發(fā)新型抗生素具有重要意義[13]。到目前為止，尚未有關(guān)于黃姑魚抗菌肽基因的研究報(bào)道。本研究嘗試從黃姑魚中克隆NK-lysin基因，分析其分子結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)進(jìn)一步檢測和分析該基因在健康組織和哈維氏弧菌感染后的不同組織的表達(dá)情況，同時(shí)分析YdNkl-2蛋白的亞細(xì)胞定位，為更進(jìn)一步研究YdNkl-2的功能及開發(fā)黃姑魚NK-lysin等抗菌肽藥物奠定基礎(chǔ)，并為開辟黃姑魚病害預(yù)防新途徑提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用黃姑魚幼魚((3.28±1.71)g)購自福建省寧德市金鈴水產(chǎn)科技有限公司。攻毒前，所有魚在充氣海水中馴養(yǎng)兩周，水溫(27.1±2.1)℃，鹽度30，水深1.0 m。每天在固定時(shí)間(每天早上7:00和下午6:00)飼喂兩次市售的黃姑魚配合飼料(天馬水產(chǎn)科技有限公司)。人工攻毒實(shí)驗(yàn)所用的哈維氏弧菌菌株分離于自然發(fā)病魚，由孫云章教授惠贈(zèng)。

從暫養(yǎng)群體中采集用于黃姑魚組織表達(dá)分析的組織(腦、心臟、鰾、腎臟、肝臟、皮膚、鰓、胃、頭腎、脾臟、小腸和肌肉)。哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)采用浸泡感染的方法進(jìn)行：在一個(gè)面積為4 m2，深度為1.5 m的混凝土水池中，將8 L細(xì)菌懸浮液(109CFU/mL)均勻潑灑在水中，使其與魚充分接觸，細(xì)菌感染過程持續(xù)3 h，之后，將所有魚轉(zhuǎn)移到裝有新曝氣海水的池子中，用次氯酸鈉對(duì)原來的池子進(jìn)行消毒。分別在哈維氏弧菌感染黃姑魚后6，12，24，48，72，96 h采集頭腎、肝臟和脾臟，置于RNA保護(hù)液中，隨后保存在-80 ℃的冰箱中。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(TransZolUp Plus RNA Kit)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoScriptTMReverse Transcription System Protocol，Promega)購自上海泰京生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司；一步克隆試劑盒(ClonExpress?II One Step Cloning Kit)和熒光定量染料(ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑、GFP Rabbit Monoclonal Antibody、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、藍(lán)色熒光染料(DAPI)、BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(15～120 ku)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)、BeyoBlueTM考馬斯亮藍(lán)快速染色液和BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(Beyotime)；胎牛血清(FBS)為Gibco公司產(chǎn)品；PBS(pH=7.4)緩沖液、胰蛋白酶消化液Trypsin EDTA Solution A(0.25%胰酶和0.02% EDTA)和DMEM High Glucose均為BI公司產(chǎn)品；雙抗(Penicillin 10000 IU/mL-Streptomycin 10 mg/mL)為MP公司產(chǎn)品。本研究所用引物均在廈門鉑瑞生物科技有限公司合成。

1.3 RNA提取及cDNA的合成

使用TransZolUp Plus RNA Kit進(jìn)行組織樣品的RNA提取，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈，并用內(nèi)參基因β-actin對(duì)cDNA合成質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.4 YdNkl-2開放閱讀框序列的克隆和載體構(gòu)建

從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的黃姑魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得YdNkl-2的開放閱讀框序列。根據(jù)ClonExpress?Ⅱ一步克隆試劑盒設(shè)計(jì)了具有EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性位點(diǎn)的特異性引物(見表1)。PCR的步驟如下：95 ℃，3 min預(yù)變性，進(jìn)行30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃變性15 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃徹底延伸5 min。將純化后的YdNkl-2產(chǎn)物連接到pEGFP-N1(本實(shí)驗(yàn)室保存)，送往鉑瑞生物技術(shù)有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.5 生物信息學(xué)分析

通過ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，包括分子量、理論等電點(diǎn)和氨基酸組成；通過SignaIP program(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號(hào)肽；通過http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/預(yù)測蛋白磷酸化；通過NetGlycate在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGlycate/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)分析；通過http://www.detaibio.com/sms2/color_align_prop.html和Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)；通過http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域；通過http://swissmodel.expasy.org/interactive預(yù)測蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并用VMD 1.9.2 beta 1編輯蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用MEGA 6.06軟件的Maximum-Likelihood法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析YdNkl-2 mRNA的表達(dá)

設(shè)計(jì)了特異性引物qYdNkl-2-F和qYdNkl-2-R(見表1)，選擇黃姑魚β-actin作為內(nèi)參基因，以稀釋80倍的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。用StepOnePlus熒光定量PCR儀，按照熒光定量染料ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix說明書進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL；正向、反向引物各0.5 μL；cDNA模板 4 μL；無菌水 5.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循環(huán)40次。最后熔解曲線步驟：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，4個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法結(jié)合SPSS 20.0中的one-way ANOVA及LSD Multiple Comparison Test進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，P<0.05表示差異顯著。

1.7 YdNkl-2的亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒GFP-YdNkl-2轉(zhuǎn)染至人類胚胎腎293T(HEK 293T)細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位。把HEK 293T細(xì)胞接種到12孔板中，培養(yǎng)基含有10%(體積分?jǐn)?shù)) FBS和1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗的DMEM，維持5%(體積分?jǐn)?shù)) CO237 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，之后，使用Lipo 8000TM轉(zhuǎn)染試劑分別將 GFP-YdNkl-2和pEGFP-N1質(zhì)粒(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

在轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞并用細(xì)胞裂解緩沖液裂解，然后通過Western blot驗(yàn)證GFP-YdNkl-2和pEGFP-N1蛋白。蛋白質(zhì)印跡步驟如下：蛋白質(zhì)樣品通過12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE處理后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；將膜用含有5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白的TBST緩沖液在室溫下封閉孵育2 h，然后轉(zhuǎn)移到GFP一抗稀釋液中4 ℃過夜；用TBST洗滌5次(每次5 min)，將膜與二抗稀釋液一起孵育2 h，再用TBST洗滌7次(每次5 min)。膜用BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測，用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)拍照。

另外，用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定細(xì)胞，0.2%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100透化細(xì)胞，0.2%(體積分?jǐn)?shù))DAPI染色。使用共焦熒光顯微鏡Leica TCS SP8系統(tǒng)(Leica，德國)觀察蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 YdNkl-2基因序列分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室組裝的黃姑魚基因組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)，YdNkl-2基因cDNA全長為600 bp，包括6 bp的5′非編碼區(qū)(UTR)、138 bp的3′非編碼區(qū)(UTR)和456 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼151個(gè)氨基酸(見圖1)。該蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量為17.04 ku，理論pI為5.21。采用SignaIP 5.0 Server預(yù)測YdNkl-2，發(fā)現(xiàn)包含一個(gè)信號(hào)肽。SMART蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測表明，YdNkl-2蛋白具有一個(gè)鞘脂激活蛋白B(saposin B)結(jié)構(gòu)域(見圖2)。通過SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫建模，YdNkl-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示，主要由多個(gè)α-螺旋組成。

2.2 YdNkl-2氨基酸同源性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

氨基酸同源性比較結(jié)果表明：黃姑魚與魚類的同源性為30.46%～81.46%(見表2)，具有較高的同源性；與其他物種一樣，含有6個(gè)保守的半胱氨酸(cysteine，C)(見圖4)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：YdNkl-2蛋白與魚類的NK-lysins聚為一支(見圖5)；哺乳動(dòng)物和鳥類各自聚為一支。結(jié)構(gòu)相似性和保守進(jìn)化關(guān)系表明：YdNkl-2蛋白是鞘脂激活蛋白樣蛋白家族的成員，并包含NK-lysin的基本特征。

表 2 YdNkl-2蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析的序列登錄號(hào)

2.3 YdNkl-2的組織表達(dá)圖譜及哈維氏弧菌感染后的表達(dá)變化

用qRT-PCR檢測YdNkl-2在健康組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示，YdNkl-2的mRNA普遍分布于各個(gè)組織，但不同組織/器官中的表達(dá)量存在差異，在鰓和脾臟中的表達(dá)量較高，而在腦和肌肉中的表達(dá)量較少。

哈維氏弧菌浸泡感染黃姑魚后，YdNkl-2在頭腎、肝臟和脾臟中的表達(dá)如圖7所示。頭腎、肝臟和脾臟中YdNkl-2的表達(dá)量均明顯升高。其中：肝臟中，YdNkl-2的mRNA表達(dá)量在24 h顯著上升并達(dá)到峰值；脾臟中，YdNkl-2的mRNA表達(dá)量在6 h顯著上升并達(dá)到峰值；頭腎中，YdNkl-2的mRNA表達(dá)量在12 h顯著上升并達(dá)到峰值。這些結(jié)果暗示YdNkl-2具有潛在的免疫功能。

2.4 YdNkl-2的亞細(xì)胞定位

YdNkl-2蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果(見圖8)顯示，GFP-YdNkl-2蛋白在HEK 293T細(xì)胞中成功表達(dá)，與實(shí)際大小一致(43 ku)；GFP-YdNkl-2蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有分布，與pEGFP-N1結(jié)果相似。

3 討論

NK-lysin的氨基酸序列具有多態(tài)性[14]，YdNkl-2與其他魚類的NK-lysin有較高的同源性(30.46%～81.46%，見表2)，而與哺乳類和鳥類的同源性只有12.57%～21.56%；不過，YdNkl-2在進(jìn)化過程中還是具有高度保守的結(jié)構(gòu)，含有一個(gè)鞘脂激活蛋白B(saposin B)結(jié)構(gòu)域和6個(gè)保守的半胱氨酸(cysteine，C)。有研究證明NK-lysin的鞘脂激活蛋白B(saposin B)結(jié)構(gòu)域與鞘脂的降解代謝有關(guān)[15]；6個(gè)保守的半胱氨酸可形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，而二硫鍵是NK-lysin發(fā)揮抗菌活性的關(guān)鍵[16]；YdNkl-2與大多數(shù)魚類[17-18]、哺乳類NK-lysin基因的結(jié)構(gòu)相似，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。綜上，YdNkl-2具有保守的結(jié)構(gòu)特征，與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。

黃姑魚鰓和脾臟中的YdNkl-2表達(dá)量較高，腦和肌肉中的較少。其他魚類也有類似的研究結(jié)果，例如：虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的NK-lysin蛋白在鰓和脾臟中高表達(dá)[19]；團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[20]和大黃魚(Larimichthyscrocea)[21]的NK-lysin蛋白在鰓和脾臟中高表達(dá)，在肌肉中表達(dá)量極低。鰓是魚類抵御病原體的第一道防線，同時(shí)脾臟是魚類的主要免疫器官，這些結(jié)果提示YdNkl-2在黃姑魚抵御病原體中發(fā)揮著重要作用。

哈維氏弧菌浸泡感染黃姑魚后，黃姑魚YdNkl-2在頭腎、肝臟和脾臟中的YdNkl-2表達(dá)量均明顯升高。在其他魚類的研究中，用lipopolysaccharide(LPS)刺激黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，頭腎中NK-lysin的表達(dá)量顯著上升并在12 h達(dá)到峰值[17]；卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)被美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)感染后，肝臟和脾臟中的NK-lysin表達(dá)量均顯著上升[6]；大黃魚被刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)刺激后，頭腎、肝臟和脾臟中的NK-lysin表達(dá)量均明顯升高[22]。這些結(jié)果表明，對(duì)于不同的免疫刺激，NK-lysin在頭腎、肝臟和脾臟等免疫器官中的表達(dá)量均顯著上升，提示NK-lysin在魚類中參與重要的免疫功能。

通過PSORT在線工具(https://www.genscript.com/psort.html)預(yù)測YdNkl-2蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示在細(xì)胞質(zhì)(21.7%)、細(xì)胞核(13.0%)、細(xì)胞外(17.4%)均有分布；通過構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒GFP-YdNkl-2進(jìn)行亞細(xì)胞定位驗(yàn)證，與在線預(yù)測結(jié)果一致，GFP-YdNkl-2蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布。NK-lysin含有一個(gè)信號(hào)肽，為分泌型蛋白，在病原體的刺激下，會(huì)被釋放到細(xì)胞外，主要通過破壞病原體的細(xì)胞膜來發(fā)揮抗菌功能[17,23-24]。

魚類抗菌肽是魚類先天免疫系統(tǒng)中的一類效應(yīng)分子，作為抵御微生物病原體入侵的第一道防線，具有抗菌活性高、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具應(yīng)用前景的抗生素的替代品。直接從生物體分離純化抗菌肽成本太高，且數(shù)量極少，而人工合成的抗菌肽較長時(shí)，又存在純化困難和成本高等一系列問題。采用分子克隆和基因工程技術(shù)體外表達(dá)抗菌肽，在新型魚病抗菌藥物開發(fā)領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。2015年我國審批通過第一個(gè)海洋動(dòng)物(大黃魚)抗菌肽基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，2016年青蟹抗菌肽基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)應(yīng)用安全證書也獲批。

研究[25]表明，將重組天蠶素抗菌肽B和天蠶素抗菌肽P1單細(xì)胞克隆入鮭魚(Chinooksalmon)胚胎細(xì)胞中，鮭魚胚胎細(xì)胞表達(dá)出來的天蠶素抗菌肽對(duì)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和安圭拉弧菌(Vibrioanguillarum)等3種病原菌有很強(qiáng)的抑制作用。在水生動(dòng)物飼料中，將抗菌肽制劑添加到魚飼料中，不僅可以提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫抗病力，而且可以提高水產(chǎn)品質(zhì)量，緩解水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌耐藥性及水產(chǎn)品抗生素污染等問題。林鑫等[26]將飼喂添加抗菌肽飼料的錦鯉感染維氏氣單胞菌10 d后的累積死亡率顯著降低，證實(shí)口服抗菌肽可以顯著提高錦鯉的抗病能力。本實(shí)驗(yàn)首次從黃姑魚中克隆到含151個(gè)氨基酸的抗菌肽，分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，具有保守的結(jié)構(gòu)特征；經(jīng)哈維氏弧菌刺激后，可誘導(dǎo)YdNkl-2在黃姑魚免疫器官中顯著上調(diào)表達(dá)，為進(jìn)一步研究其抗菌機(jī)制奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)通過酵母發(fā)酵和噴霧干燥工藝制成酵母制劑，可獲得安全高效的飼料添加劑，也可作為飼料原料或者食品的防霉抑菌劑，能有效解決海水養(yǎng)殖中的抗生素污染和飼料原料易霉變等問題，還可以研制成新型藥物，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供能夠替代抗生素的安全有效的抗菌藥物。