應(yīng)用5%果糖飲水聯(lián)合鏈脲佐菌素建立妊娠期糖尿病大鼠模型

刁天，姚燦燦，徐祥波，陳西華，賀斌*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，國家衛(wèi)生健康委員會生殖健康工程技術(shù)研究中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是一類最初診斷于妊娠中晚期(第二或第三階段)的糖尿病，且孕婦之前并不存在明確的1型或2型糖尿病[1]。GDM的定義強(qiáng)調(diào)兩點(diǎn)：一是糖尿病的癥狀于妊娠期(中或后期)出現(xiàn)；二是糖尿病的癥狀僅限于妊娠期，分娩后大多數(shù)恢復(fù)正常。近年來，隨著人們生活方式的改變，GDM的發(fā)病率逐年上升，并成為妊娠期最常伴發(fā)的代謝紊亂性疾病[2]。2019年的一項(xiàng)系統(tǒng)回顧和薈萃分析研究顯示，根據(jù)IADPSG標(biāo)準(zhǔn)，中國大陸GDM的總患病率為14.8%[3]。盡管GDM的患病率因診斷標(biāo)準(zhǔn)的不同而有所不同，但在最近幾年中仍呈上升趨勢，且隨著中國三胎政策的放開，GDM的發(fā)病率在未來幾年內(nèi)很可能會持續(xù)增加[4]。GDM對母親以及發(fā)育中的胎兒造成嚴(yán)重的不良影響，并對母親以及嬰兒以后的生活造成長遠(yuǎn)的不良影響，如患過GDM的母親在以后的生活中罹患2型糖尿病的概率會大大增加，且其后代在兒童期及成年后罹患代謝性疾病的風(fēng)險要高于正常母親的后代[2，5]。

建立契合人類GDM主要特征的實(shí)驗(yàn)動物模型對于揭示GDM的發(fā)病機(jī)制及其對母親及胎兒的影響機(jī)制、尋找干預(yù)靶點(diǎn)等至關(guān)重要。然而，GDM不是由單一的環(huán)境或遺傳因素造成的，其風(fēng)險因素包括肥胖、種族、遺傳和家族史等[6]，這使得建立完全重現(xiàn)該疾病的動物模型變得十分困難。目前常見的GDM建模方法有胰腺切除手術(shù)建模、藥物誘導(dǎo)建模如鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)[7]和四氧嘧啶(Alloxan)、飲食誘導(dǎo)建模、基因編輯及轉(zhuǎn)基因技術(shù)建模以及飲食合并STZ注射誘導(dǎo)建模等[8-10]。但現(xiàn)有的建模方法多數(shù)只能通過各種干預(yù)手段使實(shí)驗(yàn)動物在妊娠中后期出現(xiàn)高血糖，而這并不符合GDM妊娠中后期自發(fā)的出現(xiàn)血糖升高及糖耐量異常的主要特征，因此這些模型更適用于研究GDM對妊娠及胎兒的影響。因人類GDM絕大多數(shù)符合2型糖尿病特征[5]，嚙齒類動物中應(yīng)用飲食合并注射STZ作為2型糖尿病常用的建模方法[11]，已成為GDM最常用的建模方式[8-10]。該方法在妊娠前給予大鼠5周左右的高熱量飲食并在妊娠期給予小劑量STZ，通常為25 mg/kg[10]。然而，這種建模方法在妊娠期給予STZ后，大鼠多出現(xiàn)血糖過高的情況，餐后血糖達(dá)到450～540 mg/dL(25～30 mmol/L)，空腹血糖達(dá)到270～360 mg/dL(15～20 mmol/L)[9-10]，且由于STZ的促進(jìn)胰腺β細(xì)胞損傷作用，導(dǎo)致大鼠體內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)水解和脂肪分解，因此體重會相對下降[11-12]。而在人類GDM時，血糖升高及糖耐量異常癥狀多數(shù)較輕，加上醫(yī)療以及藥物的干預(yù)，嚴(yán)重的高血糖情況很少發(fā)生，實(shí)驗(yàn)動物過高血糖的表型也限制了這類模型在研究GDM中的應(yīng)用。

因此，本研究給予雌性Wistar大鼠5周果糖飲水代替高熱量飲食，并在妊娠期腹腔注射給予STZ，探索更符合人類GDM特征且均一性更好的實(shí)驗(yàn)動物GDM模型建模方法。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

雌性Wistar大鼠(8～9周齡，SPF Ⅱ級，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)50只；雄性Wistar大鼠(8～9周齡，SPF Ⅱ級，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)15只。飼養(yǎng)于國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，環(huán)境溫度20～22℃，相對濕度65%～85%，光照/黑暗12 h循環(huán)，所有大鼠均自由進(jìn)食和飲水。

所有實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作都遵循國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

二、研究方法

1.GDM實(shí)驗(yàn)動物模型的建立：50只雌性Wistar大鼠適應(yīng)一周后，隨機(jī)分為5組：正常飲食+正常飲水合并溶劑注射(NC組，n=10)；正常飲食+正常飲水合并STZ注射(STZ組，n=10)；高熱量飲食+正常飲水合并STZ注射(HDSTZ組，n=10)；正常飲食+5%(5 g/100 ml)果糖(Sigma-Aldrich，美國)飲水合并STZ注射(F5STZ組，n=10)；正常飲食+10%(10 g/100 ml)果糖飲水合并STZ注射(F10STZ組，n=10)。不同的飲食飲水持續(xù)5周后，雌雄大鼠按照1：1的比例于20：00 pm合籠，次日上午見陰栓則記為妊娠第0.5天(GD0.5)。GD6.5晚20：00 pm禁食，禁食期間自由飲水，GD7.5上午10：00 am，NC組雌性大鼠按照25 mg/kg體重腹腔注射溶劑(0.1 mol/L，pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液無菌溶液)，其余各組雌性大鼠按照25 mg/kg體重腹腔注射STZ[9-10]。

北京科澳協(xié)力飼料有限公司的大/小鼠生長維持飼料和2型糖尿病飼料分別作為正常飼料和高熱量飼料。2型糖尿病飼料含有10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、0.5%膽酸鈉和67%的大/小鼠生長維持飼料。5%和10%的果糖飲水每日配制。

腹腔注射用STZ(Sigma-Aldrich，美國)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配：用0.1 mol/L 的檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)無菌溶液配制1%(1 g/100 ml)的STZ溶液，溶液配制完成到注射前避光保存。

2.體重監(jiān)測：分別在適應(yīng)1周后的基線時(W0)、飲食/飲水干預(yù)1周后(W1)、2周后(W2)、3周后(W3)、4周后(W4)、5周后(W5)、GD7.5和GD19.5測量每組雌性大鼠的體重。

3.血糖水平及葡萄糖糖耐量檢測：用羅氏血糖儀(Accu-Chek Active[型號GB]，德國)分別在W0、W5、GD7.5、GD10.5、GD15.5和GD19.5檢測各組雌性大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)；在GD6.5、GD9.5、GD13.5、GD16.5、GD20.5測量各組大鼠的餐后血糖(postprandial blood glucose，PBG)。將雌性大鼠禁食10 h(9：00 am至19：00 pm)后測量FBG，禁食期間自由飲水，并將F5STZ組和F10STZ組的果糖飲水更換為正常飲用水；在非禁食狀態(tài)下當(dāng)日14：00 pm測量PBG。分別在W0、W5和GD19.5對各組雌性大鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。實(shí)驗(yàn)前將雌性大鼠禁食10 h(9：00 am至19：00 pm)，禁食期間自由飲水，并將F5STZ組和F10STZ組的果糖飲水更換為正常飲用水。在用50%(0.5 g/1 ml)葡萄糖(北京索萊寶)溶液(用蒸餾水配置)灌胃之前，測量大鼠的FBG，并通過尾靜脈采集空腹外周血于離心管中，用于后續(xù)生化分析。將50%的葡萄糖溶液按2 g/kg體重的劑量對大鼠進(jìn)行灌胃，分別在0、10、15、30、45、60、90、120 min后測量血糖，并計(jì)算曲線下面積(AUC)。

4.血生化分析：將上述采集的空腹外周血于4℃、3 000 r/min離心15 min，收集血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定空腹血清中胰島素的濃度(Mercodia Rat insulin ELISA kit，瑞典)；采用比色法(南京建成生物工程研究所)測定空腹血清中甘油三酯(TGs)的濃度。

5.胎盤及胎兒的數(shù)量和重量：于GD20.5處死大鼠，小心剝離胎盤及胎兒，拍照記錄胎盤形態(tài)并稱重，記錄胎兒數(shù)量并稱重。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組大鼠的體重變化比較

在飲食/飲水干預(yù)5周(W5)時，與NC組[(268.00±4.234)g]比較，HDSTZ組[(283.40±4.372)g]和F10STZ組[(291.98±5.518)g]的體重均顯著增加(P<0.05)，而F5STZ組體重接近NC組(P>0.05)。GD7.5時，與NC組比較，F(xiàn)10STZ組的體重顯著升高(P<0.05)(圖1A)。在GD7.5給予STZ后，至GD19.5時各組的體重增幅結(jié)果顯示，與對照組比較，除HDSTZ組體重增幅顯著減少(P<0.05)，其他各組盡管增幅有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1B)。

A：各組大鼠體重變化。與相同時間點(diǎn)NC組比較，*P<0.05；B：GD7.5～GD19.5體重增量。與NC組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠的體重變化結(jié)果

二、各組大鼠的血糖檢測結(jié)果

經(jīng)過5周不同的飲食或飲水干預(yù)后，與NC組相比，F(xiàn)10STZ組的空腹血糖(FBG)水平顯著升高(P<0.05)，其余各組FBG水平盡管略有上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2A)；各組的餐后血糖(PBG)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2B)。

當(dāng)給予STZ注射后，STZ組的血糖在GD9.5時有所升高(150 mg/dL左右)，GD13.5后恢復(fù)至NC組水平；HDSTZ組血糖則劇烈升高，PBG水平高達(dá)350～400 mg/dL，F(xiàn)BG也達(dá)到250～300 mg/dL；F5STZ組和F10STZ組的PBG波動在250～300 mg/dL，F(xiàn)BG波動在150～200 mg/dL，介于NC組與HDSTZ組之間(圖2C)。由各組大鼠GD16.5時PBG分布情況可以看出，HDSTZ組、F5STZ組和F10STZ組分別有60%(n=6)、10%(n=1)和30%(n=3)的大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高血糖(PBG>360 mg/dL)(圖2D)。至妊娠末期(GD19.5和GD20.5)各組的FBG和PBG均有所降低(圖2C)。

A：飲食或飲水干預(yù)5周前后各組大鼠FBG水平的變化；B：飲食或飲水干預(yù)5周前后各組大鼠PBG水平的變化；C：妊娠期間各組大鼠的FBG及PBG水平變化，其中GD6.5、9.5、13.5、16.5和20.5為PBG水平；GD7.5、10.5、15.5和19.5為FBG水平；D：各組大鼠GD16.5時PBG散點(diǎn)圖。與相同時間點(diǎn)NC組比較，*P<0.05。圖2 各組大鼠的血糖水平變化結(jié)果

三、各組大鼠口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)結(jié)果比較

口服葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果顯示：在W0時，各組的糖耐量水平相當(dāng)(圖3A、D)；在W5時，與NC組相比，F(xiàn)5STZ組和F10STZ組的大鼠在被給予50%葡萄糖溶液灌胃后，血糖峰值明顯升高且2 h血糖仍高于NC組(圖3B)，AUC顯著增加(P<0.01)(圖3D)；在GD19.5時，與NC組相比，HDSTZ組、F5STZ組和F10STZ組的大鼠在被給予50%葡萄糖溶液灌胃后，血糖峰值明顯升高，HDSTZ組和F10STZ組2 h后血糖仍分別高達(dá)約330 mg/dL和240 mg/dL，F(xiàn)5STZ組2 h后血糖約為180 mg/dL，仍高于空腹時水平(圖3C)，3組的AUC顯著增加(P<0.01)，且以HDSTZ組最為顯著(圖3D)。

A：基線時(W0)各組大鼠在50%葡萄糖溶液灌胃后血糖水平隨時間的變化；B：飲食或飲水干預(yù)5周后(W5)各組大鼠在50%葡萄糖溶液灌胃后血糖水平隨時間的變化；C：GD19.5各組大鼠在50%葡萄糖溶液灌胃后血糖水平隨時間的變化；D：3次OGTT試驗(yàn)結(jié)果的AUC統(tǒng)計(jì)。圖B、C圖例同圖A；與相同時間點(diǎn)NC組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 各組大鼠的葡萄糖耐量變化結(jié)果

四、各組大鼠空腹血清胰島素和甘油三酯濃度變化比較

在W5時，與NC組相比，HDSTZ組和F10STZ組的空腹血清胰島素濃度均顯著升高(P<0.05)；在GD19.5時，與NC組相比，其余4組的空腹血清胰島素濃度均顯著升高(P<0.05)(圖4A)。在W5時，與NC組相比，F(xiàn)5STZ組和F10STZ組的空腹血清甘油三酯濃度均顯著升高(P<0.05)；在GD19.5時，與NC組相比，其余4組的空腹血清甘油三酯濃度均顯著升高(P<0.05)(圖4B)。

A：基線時(W0)、飲食或飲水干預(yù)5周后(W5)和GD19.5各組大鼠空腹血清中的胰島素濃度；B：基線時(W0)、飲食或飲水干預(yù)5周后(W5)和GD19.5各組大鼠空腹血清中的甘油三酯濃度。與相同時間點(diǎn)NC組比較，*P<0.05。圖4 各組大鼠空腹血清胰島素和甘油三酯濃度變化結(jié)果

五、各組大鼠胎盤大體形態(tài)學(xué)比較

與NC組(PBG穩(wěn)定在90～180 mg/dL)比較，F(xiàn)5STZ組(PBG波動在270～360 mg/dL)大鼠的胎盤體積略增大，顏色無明顯變化；HDSTZ組(PBG波動在450～540 mg/dL)大鼠的胎盤體積略增大，表面顏色更深，呈暗紅色(圖5)。

圖5 NC組、F5STZ組和HDSTZ組大鼠的胎盤大體形態(tài)學(xué)改變

六、各組大鼠妊娠結(jié)局比較

從表1中可以看出，與NC組比較，HDSTZ組的平均胎鼠數(shù)量顯著降低(P<0.05)，與取材時該組部分孕鼠可見1～3個吸收胎相一致；F5STZ組的平均胎鼠數(shù)量無顯著改變(P>0.05)。HDSTZ組和F5STZ組的胎鼠重量均顯著高于NC組(P<0.05)。STZ組、HDSTZ組、F5STZ組和F10STZ組的胎盤重量相對于NC組均顯著升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠胎鼠數(shù)量及重量和胎盤重量結(jié)果比較(-±s)

討 論

本研究應(yīng)用5周正常飲食合并5%果糖飲水并于GD 7.5 按25 mg/kg體重腹腔注射STZ建立妊娠期糖尿病實(shí)驗(yàn)動物模型，與常用的5周高熱量飲食并于妊娠期按25 mg/kg體重注射STZ相比，妊娠期大鼠高血糖癥狀較輕，且妊娠末期葡萄糖耐量異常程度較輕，更加契合人類GDM特征。

目前GDM實(shí)驗(yàn)動物模型最常用的建模方法為5周高熱量飲食，并于妊娠期給予小劑量STZ[8-10]。經(jīng)過5周的飲食誘導(dǎo)，大鼠出現(xiàn)肥胖、糖耐量異常、高脂血癥等病理現(xiàn)象；在給予STZ后，大鼠出現(xiàn)高血糖[9-10]，符合GDM慢性胰島素抵抗背景下的葡萄糖耐受不良的主要特征。然而，這種方法誘導(dǎo)的高血糖大鼠的PBG高達(dá)450～540 mg/dL(25～30 mmol/L)，已達(dá)到正常Wistar大鼠PBG[(101.7±29.34)mg/dL，(5.65±1.63)mmol/L][13]的5倍左右；FBG達(dá)到270～360 mg/dL(15～20 mmol/L)[9-10]，也高達(dá)正常Wistar大鼠FBG[(71.1±23.58)mg/dL，(3.95±1.31)mmol/L][13]的4倍左右，表明此類建模方法誘導(dǎo)的GDM大鼠妊娠期的血糖明顯過高。推測可能的原因?yàn)楦邿崃匡嬍痴T導(dǎo)了肥胖表型，因此當(dāng)妊娠期按照25 mg/kg體重注射STZ時，STZ的實(shí)際注射量是比較高的，可能過度損傷了胰島β細(xì)胞，故出現(xiàn)了嚴(yán)重的血糖升高，過高的血糖水平還會導(dǎo)致吸收胎的比率增加[14]。而在人類GDM時，由于醫(yī)療和藥物等的干預(yù)，這種嚴(yán)重高血糖的情況很少出現(xiàn)，因此這種模型可能更適用于研究妊娠期嚴(yán)重的高血糖對妊娠及胎兒等的影響。此外，GD7.5給予STZ后，HDSTZ組GD7.5至GD19.5的體重增幅顯著減少，提示可能與HDSTZ組的胚胎數(shù)量減少有關(guān)(表1)。

鑒于果糖在誘導(dǎo)胰島素抵抗方面的能力[15]以及10%果糖飲水已成為誘導(dǎo)大鼠代謝綜合征常用的建模方法[16]，本研究嘗試給予雌性大鼠5周正常飲食及5%或10%果糖飲水(F5STZ組、F10STZ組)。處理5周后(W5)，與其他3組相比，F(xiàn)5STZ組和F10STZ組大鼠即出現(xiàn)了糖耐量異常(圖3B、D)，表明果糖誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)糖耐量異常的能力要強(qiáng)于單純的高熱量飲食。至GD7.5時，與正常飲食飲水對照組(NC組)相比，F(xiàn)5STZ組和F10STZ組的體重也呈現(xiàn)升高趨勢，但未及高熱量飲食組(HDSTZ組)明顯(圖1A)。在給予STZ后，妊娠期HDSTZ組、F5STZ組和F10STZ組均表現(xiàn)明顯的高血糖及葡萄糖耐受不良，其中分別有60%、10%和30%的大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高血糖(PBG>360 mg/dL)(圖2C)，以F5STZ組出現(xiàn)嚴(yán)重高血糖的比例最低，且F5STZ組血糖的一致性更佳。鑒于GD7.5時F5STZ組的體重與HDSTZ組相比無明顯差異，但注射STZ后，F(xiàn)5STZ組的血糖升高得更加溫和(圖1B)；且F10STZ組的體重要高于HDSTZ組，但其出現(xiàn)嚴(yán)重高血糖的比例要低于HDSTZ組，表明大量的果糖攝入可能通過某種作用機(jī)制緩解了STZ對大鼠胰島β細(xì)胞的破壞，或者誘導(dǎo)了某種代償性機(jī)制以拮抗血糖異常。OGTT結(jié)果提示HDSTZ、F5STZ和F10STZ組在GD19.5時表現(xiàn)出明顯的葡萄糖耐受不良，且HDSTZ、F10STZ組較F5STZ組尤為顯著(圖3C、D)。另外，實(shí)驗(yàn)各組(STZ組、HDSTZ組、F5STZ組和F10STZ組)在GD19.5時均出現(xiàn)了脂代謝異常，以HDSTZ組最為顯著(圖4B)。因此，5周5%果糖飲水并于GD7.5腹腔注射STZ這種建模方法誘導(dǎo)的高血糖、糖耐量異常及血脂異常表型均較輕，更符合人GDM 的特征。

此外，盡管肥胖是GDM最大的誘因，臨床上仍有相當(dāng)一部分GDM患者的體重在正常范圍內(nèi)[17]，因此聯(lián)合應(yīng)用正常飲食+5%果糖飲水和妊娠期STZ注射更適用于研究這類情況。同時，F(xiàn)5STZ組的胚胎數(shù)量未受到影響，且與NC組相比，F(xiàn)5STZ組的胎鼠體重、胎盤重量也顯著增加(P<0.05)(表1)，符合妊娠期糖尿病伴隨出現(xiàn)“大胎兒”和“大胎盤”的特點(diǎn)[18-19]。而HDSTZ組大鼠妊娠期血糖過高，并呈現(xiàn)暗紅色，很可能已經(jīng)嚴(yán)重影響了胎盤的血管發(fā)育(圖5)。

綜上所述，本研究探索出了一種新的大鼠GDM模型建模方法，該方法大鼠血糖升高及糖耐量異常均較溫和，更加契合人GDM特征，因此應(yīng)用這種建模方法建立GDM動物模型對于揭示GDM對妊娠、胎盤及胎兒等的影響及其機(jī)制更有意義。