GnRH-a降調(diào)節(jié)在整倍體單囊胚解凍移植中的臨床應(yīng)用分析

賈博欽，蔣彥，宋歌，朱玉林，吳小華

(石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院，石家莊 050011)

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)后整倍體凍融胚胎移植(FET)成功的關(guān)鍵因素之一是選擇恰當(dāng)?shù)膬?nèi)膜準(zhǔn)備方案。常用的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案有自然周期方案、人工周期方案，自然周期方案適用于月經(jīng)周期規(guī)律者，但需要患者連續(xù)監(jiān)測(cè)卵泡，且經(jīng)常由于卵泡發(fā)育異常而取消周期可能性較大[1]。人工周期方案具有給藥方便、復(fù)診次數(shù)少和周期取消率低等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用較自然周期更加廣泛，包括單純激素替代方案及加用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)的降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案，加用GnRH-a預(yù)處理可實(shí)現(xiàn)垂體下調(diào)，更好地避免自發(fā)排卵和周期取消[2]。目前大量研究認(rèn)為，降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案較單純激素替代方案能明顯改善子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征(PCOS)等人群的妊娠結(jié)局[3-4]。但這兩種人工周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案在無明顯合并癥的普通人群中研究較少。有研究顯示，在普通人群中GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方案較單純激素替代方案的凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局沒有明顯差別[5-6]；但也有研究顯示，普通人群在解凍移植前應(yīng)用GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方案較單純激素替代方案獲得更高的臨床妊娠率[7-9]。目前關(guān)于PGT后解凍移植更適于采用哪種人工周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案尚缺乏相關(guān)研究，而PGT助孕人群中無明顯合并癥的普通人群居多，故研究PGT助孕普通人群對(duì)指導(dǎo)PGT臨床更有意義。本研究回顧性分析本院應(yīng)用PGT后行GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案及單純激素替代方案FET的臨床結(jié)局，探討GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方法對(duì)整倍體單囊胚解凍移植妊娠結(jié)局的影響。

材料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2019年3月至2021年6月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心PGT檢測(cè)后應(yīng)用人工周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的解凍移植周期103例。納入標(biāo)準(zhǔn)：PGT后解凍移植采用兩種人工周期方案進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備；夫婦需有合理、充分的PGT助孕臨床指征，且進(jìn)行了充分的遺傳咨詢；以上持續(xù)妊娠患者的產(chǎn)前診斷結(jié)果符合PGT胚胎遺傳學(xué)診斷結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有子宮內(nèi)膜異位癥(Ⅲ-Ⅳ期)、PCOS、中重度輸卵管積水、子宮肌瘤(粘膜下)、嚴(yán)重的子宮畸形、宮腔粘連病史。

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)及胚胎活檢：PGT周期常規(guī)采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)受精，受精后16～18 h觀察原核，37℃三氣培養(yǎng)箱(5% CO2、5% O2和90% N2)中G系列序貫培養(yǎng)培養(yǎng)至囊胚活檢，每枚囊胚活檢3～7個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行MALBAC全基因組擴(kuò)增，二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)[10]。優(yōu)質(zhì)囊胚為囊胚擴(kuò)張程度≥3期且≥BB級(jí)[11]，將移植囊胚分為優(yōu)質(zhì)囊胚和非優(yōu)質(zhì)囊胚。囊胚活檢后單管玻璃化冷凍，待胚胎遺傳學(xué)分析完成后擇期對(duì)可移植胚胎進(jìn)行復(fù)蘇移植，復(fù)蘇采用梯度置換后37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。

2.內(nèi)膜準(zhǔn)備方法：將研究對(duì)象根據(jù)在內(nèi)膜準(zhǔn)備過程中是否注射GnRH-a進(jìn)行預(yù)處理分為兩組，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組(研究組)為53例，單純激素替代組(對(duì)照組)為50例。(1)研究組處理方法：月經(jīng)2～3 d時(shí)，彩超檢查子宮附件無異常，給予肌肉注射GnRH-a(貝依，上海麗珠)3.75 mg，28 d后復(fù)診進(jìn)行激素替代?；颊呙咳湛诜焖岽贫?補(bǔ)佳樂，拜耳藥業(yè)，德國(guó))6～8 mg，6～8 d后超聲檢測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，適時(shí)調(diào)整用藥劑量；藥物應(yīng)用14～16 d后行超聲檢查并對(duì)雌二醇(E2)及孕酮(P)水平進(jìn)行檢測(cè)；超聲顯示子宮內(nèi)膜厚度≥0.8 cm[12]，則開始進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，即每日口服地屈孕酮(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)20 mg及肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg；囊胚解凍移植在轉(zhuǎn)化6 d后進(jìn)行，移植后繼續(xù)以上用藥。(2)對(duì)照組處理方法：月經(jīng)2～5 d時(shí)，彩超檢查子宮附件無異常，開始激素替代，其內(nèi)膜準(zhǔn)備、內(nèi)膜轉(zhuǎn)化及黃體支持藥物的用法用量同降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組。臨床妊娠者于孕8周起逐步減藥，孕12周時(shí)停藥物支持，孕16～20周的持續(xù)妊娠者需在本院產(chǎn)前診斷中心行產(chǎn)前診斷。

3.妊娠判斷標(biāo)準(zhǔn)：我中心PGT解凍移植采用單囊胚移植，均為整倍體胚胎。移植后28～35 d彩超提示宮內(nèi)探及孕囊回聲定義為臨床妊娠。持續(xù)妊娠為孕16周及以上者通過超聲監(jiān)測(cè)提示宮內(nèi)活胎[13]。

4.觀察指標(biāo)：患者基礎(chǔ)臨床資料，包括女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)、竇卵泡數(shù)(AFC)、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、轉(zhuǎn)化日E2及P水平等；臨床結(jié)局包括臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、優(yōu)質(zhì)囊胚移植率、優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率和非優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，持續(xù)妊娠率=持續(xù)妊娠周期數(shù)(包括已活產(chǎn)者)/移植周期數(shù)×100%，優(yōu)質(zhì)囊胚移植率=優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率=優(yōu)質(zhì)囊胚移植妊娠周期數(shù)/優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期數(shù)×100%，非優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率=非優(yōu)質(zhì)囊胚移植妊娠周期數(shù)/非優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況比較

本研究共納入PGT后應(yīng)用人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜的103例患者、103個(gè)FET周期，其中GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組(研究組)53例，單純激素替代組(對(duì)照組)50例。兩組患者的女方年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、AFC、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、轉(zhuǎn)化日E2水平及P水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較(-±s)

二、兩組患者妊娠結(jié)局比較

兩組患者共獲得臨床妊娠65例，早期流產(chǎn)2例，目前共獲得43例健康新生兒，均無明顯出生缺陷發(fā)生，尚有20例妊娠中。研究組的臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；兩組患者優(yōu)質(zhì)囊胚移植率比較無顯著性差異(P>0.05)；研究組的優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，研究組的非優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率雖高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者妊娠結(jié)局比較(%)

三、Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

校正了兩組患者一般臨床資料及是否優(yōu)胚移植的混雜因素后，研究組相對(duì)于對(duì)照組的臨床妊娠率校正OR值為 3.788，95%CI(1.522，9.431)，最終模型的 Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)結(jié)果表明模型擬合較好，表明GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方案較單純激素替代方案可以提高PGT后整倍體單囊胚解凍移植的臨床妊娠率(表3)。

表3 二元Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

校正了兩組患者一般臨床資料及是否優(yōu)胚移植的混雜因素后，研究組相對(duì)于對(duì)照組的持續(xù)妊娠率校正OR值為2.974，95%CI(1.232，7.180)。最終模型的Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)結(jié)果表明模型擬合較好，表明GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方案較單純激素替代方案可以提高PGT后整倍體單囊胚解凍移植的持續(xù)妊娠率(表4)。

表4 Logistic回歸分析持續(xù)妊娠率的影響因素

討 論

由于獲得胚胎遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果需要一定時(shí)間，PGT助孕患者胚胎需全胚冷凍，故解凍移植成為PGT助孕的關(guān)鍵步驟。隨著PGT技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，經(jīng)PGT技術(shù)篩選的整倍體胚胎可排除胚胎異常因素對(duì)妊娠結(jié)局造成的影響，在這一前提下，本研究中PGT后解凍移植前兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方法比較得出的結(jié)果更準(zhǔn)確。同時(shí)研究結(jié)果也可對(duì)經(jīng)過層層篩選，獲得珍貴胚胎的PGT助孕人群選擇解凍移植內(nèi)膜準(zhǔn)備方案起到一定的指導(dǎo)作用。

本研究回顧了本院生殖中心近2年P(guān)GT應(yīng)用人工周期內(nèi)膜準(zhǔn)備的103例解凍移植周期，研究對(duì)象為無子宮內(nèi)膜異位癥(Ⅲ-Ⅳ期)、PCOS、中重度輸卵管積水、粘膜下子宮肌瘤等合并癥的人群，將研究對(duì)象內(nèi)膜準(zhǔn)備根據(jù)是否進(jìn)行GnRH-a預(yù)處理分為GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案組和單純激素替代方案組；將兩組患者的一般情況及妊娠結(jié)局進(jìn)行了組間比較，結(jié)果表明GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率均顯著高于單純激素替代組，且在兩組優(yōu)質(zhì)囊胚移植率無顯著差異情況下，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組不論優(yōu)質(zhì)還是非優(yōu)質(zhì)囊胚其臨床妊娠率均高于單純激素替代組，且前者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，在校正了女方年齡、BMI等一般情況及是否優(yōu)胚移植的差異因素后，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組相比于單純激素替代組的臨床妊娠率校正OR值為3.788，95%CI(1.522，9.431)，持續(xù)妊娠率校正OR值為2.974，95%CI(1.232，7.180)。表明在整倍體囊胚移植時(shí)，排除其他因素后，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代較單純替代周期進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備可獲得更高的臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率。相似的，國(guó)外一項(xiàng)研究表明，與單純激素替代周期(n=100)相比，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代周期(n=110)具有更高的種植率和妊娠率[7]。Kang等[8]在排除了PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥(Ⅳ期)的人群中對(duì)單純激素替代周期FET(n=88)與GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代周期FET(n=181)的臨床結(jié)局進(jìn)行比較，結(jié)果表明，妊娠率在GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代周期中較高，但活產(chǎn)率無顯著差異。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)對(duì)非子宮內(nèi)膜異位癥人群中解凍移植研究中，對(duì)GnRH-a降調(diào)節(jié)后激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備組(試驗(yàn)組)807個(gè)周期及單純激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備組(對(duì)照組)2 755個(gè)周期進(jìn)行妊娠結(jié)局比較，揭示在校正了混雜因素的多因素后也驗(yàn)證了前者較后者能獲得更高的臨床妊娠率與活產(chǎn)率[9]，但以上研究均未排除胚胎異常因素對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案較單純激素替代方案能夠獲得更高的臨床妊娠率，考慮可能的相關(guān)因素如下：(1)單純激素替代方案子宮內(nèi)膜可在外源性雌激素的作用下有效生長(zhǎng)，之后在外源性孕酮的作用下子宮內(nèi)膜種植窗的開放得以啟動(dòng)，從而有效把握胚胎移植的時(shí)機(jī)，但外源的E2仍可直接或間接作用于下丘腦GnRH 神經(jīng)元，增加 GnRH 釋放脈沖的幅度，促使 GnRH 受體增多和垂體對(duì)其敏感性增強(qiáng)，可能會(huì)引起早發(fā)性的LH峰，從而影響子宮內(nèi)膜的微環(huán)境，干擾胚胎著床[14]。長(zhǎng)效GnRH-a的作用原理是持續(xù)應(yīng)用后垂體的GnRH受體被耗盡，降低了垂體分泌促性腺激素，從而導(dǎo)致卵巢無卵泡周期性發(fā)育，有效抑制內(nèi)源性LH峰，彌補(bǔ)單純激素替代方案無法保證完全垂體抑制的缺陷，同時(shí)GnRH-a可提高內(nèi)膜對(duì)外源性E2敏感性，改善子宮內(nèi)膜分型[15]。(2)長(zhǎng)效GnRH-a的應(yīng)用可以減少內(nèi)源性雌激素的釋放，血清雌激素水平的降低可能會(huì)改變后期子宮內(nèi)膜上種植窗的形成，亦有利于胚胎早期種植[16-17]；同時(shí)GnRH-a抑制HPO軸，降低卵泡期孕酮水平，防止種植窗提前開放，提高子宮內(nèi)膜容受性，從而改善妊娠結(jié)局[18]。(3)研究發(fā)現(xiàn)，GnRH 受體不僅存在于垂體，同時(shí)也存在于子宮內(nèi)膜組織[19]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，圍種植期間的胚胎發(fā)育與GnRH-a 的增加呈正相關(guān)性，圍種植期的胚胎表面存在GnRH-a受體，提示GnRH-a的長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)子宮內(nèi)膜容受性和胚胎發(fā)育都有獲益[20]。研究推測(cè)，GnRH-a預(yù)處理后GnRHa 可能通過結(jié)合于胚胎及子宮內(nèi)膜上的GnRH受體，抑制胚胎毒性自身抗體的產(chǎn)生、增加子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附分子整合素avβ3的表達(dá)，從而改善內(nèi)膜容受性[21]。這與國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究結(jié)論一致，后者還提出長(zhǎng)效GnRH-a還可以提高種植窗期子宮內(nèi)膜表面的白血病抑制因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胞飲突的表達(dá)，降低腹腔中白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子等胚胎毒性因子的濃度，明顯改善盆腔及子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境，利于胚胎著床，提高臨床妊娠率[22]。

綜上所述，在應(yīng)用GnRH-a進(jìn)行降調(diào)節(jié)后，子宮內(nèi)膜的容受性可能通過以上途徑得到改善，從而更有利于胚胎著床。且目前從本研究統(tǒng)計(jì)差異結(jié)果來看，經(jīng)PGT篩選的整倍體單囊胚進(jìn)行解凍移植時(shí)，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準(zhǔn)備方案可能優(yōu)于單純激素替代方案。但近兩年受新冠肺炎疫情影響，我中心經(jīng)PGT檢測(cè)后凍融胚胎移植周期尚少，故需繼續(xù)累積周期數(shù)，同時(shí)需大樣本量進(jìn)行前瞻性的研究，并對(duì)以上標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，以期得出更為有意義、更具統(tǒng)計(jì)說服力的結(jié)果來更好的指導(dǎo)臨床。