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    流產(chǎn)組織染色體整倍性對同一取卵周期凍融胚胎移植妊娠結(jié)局的影響

    2022-06-18 13:22:26趙偉娥陳攀宇李玉潔賈磊梁曉燕
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2022年6期
    關(guān)鍵詞:研究

    趙偉娥,陳攀宇,李玉潔,賈磊,梁曉燕

    (中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心,廣州 510000)

    自然流產(chǎn)占妊娠總數(shù)的10%~15%,與胚胎、母體、父親以及環(huán)境等因素有關(guān),胚胎非整倍體是導(dǎo)致流產(chǎn)最常見原因,占50%~60%[1]。因此,檢測流產(chǎn)組織的染色體對后續(xù)妊娠具有重要指導(dǎo)意義。輔助生殖(ART)治療中,常采用控制性促排卵(COH) 增加卵母細(xì)胞數(shù)目,使患者有剩余胚胎進(jìn)行優(yōu)選并冷凍,為患者提供盡可能多的移植機(jī)會。對發(fā)生過自然流產(chǎn),尤其是因胚胎非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)的夫婦而言,移植同一取卵周期的胚胎,自然流產(chǎn)或胚胎染色體異常的風(fēng)險會增加,從而陷入是否丟棄這些胚胎或行胚胎植入前非整倍體檢測(PGT-A)的困惑。目前,關(guān)于一次胚胎非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)是否影響同一取卵周期來源胚胎的妊娠結(jié)局,尚無相關(guān)研究。本研究對流產(chǎn)組織染色體結(jié)果為整倍體或非整倍體時移植同一取卵周期來源胚胎后的臨床結(jié)局進(jìn)行分析,觀察流產(chǎn)組織染色體整倍性對凍融胚胎移植(FET)的妊娠結(jié)局的影響,以期為同一取卵周期的冷凍胚胎再次移植提供指導(dǎo)。

    資料與方法

    一、研究對象

    回顧性分析2012年3月至2020年1月在本中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的臨床資料,對其稽留流產(chǎn)所行的清宮術(shù)中留取的流產(chǎn)組織行染色體核型分析,收集同一取卵周期有冷凍胚胎并行FET的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)包括:(1)既往有自然流產(chǎn)史;(2)反復(fù)種植失??;(3)雙方或一方有染色體異常;(4)生殖道畸形等。

    二、研究方法

    1.促排卵與胚胎培養(yǎng):根據(jù)患者年齡、卵巢儲備、既往對促排卵藥物的反應(yīng)性等,個體化選擇長方案或者拮抗劑方案。根據(jù)男方精液情況,行常規(guī)IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI),18~20 h后觀察受精情況,出現(xiàn)兩個原核為正常受精。72 h后觀察胚胎并評分,對于符合囊胚培養(yǎng)條件的胚胎,轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)[2],在第5天觀察胚胎質(zhì)量并評分,評分標(biāo)準(zhǔn)參考Gardner評分系統(tǒng)[3]。

    2.胚胎冷凍與復(fù)蘇:胚胎冷凍采用玻璃化冷凍方法[2]。冷凍時使用三種平衡溶液:A液為含12 mg/ml人血清白蛋白的4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES,Quinn’s,美國)平衡溶液,B液為A液+7.5%乙二醇+7.5%二甲亞砜,C液為A液+15%乙二醇+15%二甲亞砜。將胚胎依次放入A液2 min、B液2 min以及C液1 min后,30 s內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍載體,保存在液氮中。胚胎復(fù)蘇時,將胚胎從液氮中取出,在含0.33 mol/L蔗糖+10%血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡2 min,然后轉(zhuǎn)移至含0.2 mol/L蔗糖+10%血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡3 min,再轉(zhuǎn)移至含10% 血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡5 min后,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

    3.凍融周期的內(nèi)膜準(zhǔn)備:自然周期(NC):既往排卵規(guī)律的患者,定期經(jīng)陰道B超及血雌激素(E2)水平監(jiān)測卵泡發(fā)育情況以及內(nèi)膜厚度,確定排卵時間,排卵后若內(nèi)膜≥7 mm,第3天移植卵裂期胚胎或第5天移植囊胚期胚胎。替代周期(HRT):既往無規(guī)律排卵的患者,月經(jīng)第2~3天使用戊酸雌二醇(拜耳制藥,德國),根據(jù)內(nèi)膜生長情況與E2水平調(diào)整用藥,當(dāng)內(nèi)膜厚度≥7 mm且用藥時間不少于10 d時,給予陰道用黃體酮(Besins,比利時)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜,第3天移植卵裂期胚胎,第5天移植囊胚期胚胎。

    4.流產(chǎn)組織收集、培養(yǎng)與染色體核型分析:稽留流產(chǎn)患者常規(guī)行清宮術(shù),術(shù)中在無菌條件下將絨毛組織與蛻膜、血塊等分離,留取絨毛組織并置入含有抗生素的培養(yǎng)液中送入實(shí)驗室行絨毛細(xì)胞培養(yǎng)。每個標(biāo)本采取雙線培養(yǎng),將絨毛組織用膠原酶II和胰酶消化后置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)絨毛細(xì)胞生長到適宜密度后回收細(xì)胞固定,制備染色體核型分析玻片,將玻片放入胰酶溶液中靜置20~30 s,甩干后放入吉姆薩染液中染色4~5 min,蒸餾水中漂洗一次晾干。染色體結(jié)果判讀參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名國際體制[4]。每例染色體標(biāo)本計數(shù)分析20個以上核型,如果檢出核型異常,則分析50個核型,存在嵌合體則分析100個核型。

    5.妊娠結(jié)局及觀察指標(biāo):臨床妊娠定義為陰道B超證實(shí)的胚胎位于子宮內(nèi)且有胎心者;早期流產(chǎn)定義為12周之前的胚胎丟失;不論孕周大小,至少獲得一個存活嬰兒定義為活產(chǎn)。觀察指標(biāo)如下:臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%、早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%、活產(chǎn)率=活產(chǎn)數(shù)/移植周期數(shù)×100%、累積活產(chǎn)率=所有活產(chǎn)數(shù)/患者例數(shù)×100%。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、一般臨床資料

    本研究共納入380例患者、539個周期。根據(jù)流產(chǎn)組織染色體結(jié)果將其分為兩組:整倍體組(206例患者、292個周期)與非整倍體組(174例患者、247個周期)。整倍體組取卵時年齡顯著小于非整倍體組(P<0.05),AMH值顯著高于非整倍體組AMH(P<0.05),原發(fā)不孕占比顯著高于非整倍體組(P=0.02)。兩組患者BMI與流產(chǎn)孕周比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

    表1 整倍體組與非整倍體組臨床資料[(-±s),%]

    二、兩組患者同一取卵周期冷凍胚胎移植情況比較

    兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)換日的內(nèi)膜厚度與E2水平、平均移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、平均移植周期數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),囊胚移植占比在兩組中無顯著差異(P>0.05)。整倍體組中,替代周期占比更高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)(表2)。

    表2 兩組患者同一取卵周期冷凍胚胎移植情況比較[(-±s),%]

    三、兩組患者同一取卵周期FET的妊娠結(jié)局

    兩組患者的臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

    表3 兩組患者同一取卵周期FET的妊娠結(jié)局比較(%)

    四、兩組患者臨床結(jié)局的GEE分析

    流產(chǎn)組織染色體結(jié)果與臨床妊娠率及活產(chǎn)率無相關(guān)性(P-adj>0.05),取卵時年齡、移植胚胎數(shù)目是影響臨床妊娠率及活產(chǎn)率的獨(dú)立危險因素(P-adj<0.05)(表4)。

    表4 整倍體組與非整倍體組臨床結(jié)局的GEE分析

    討 論

    本研究分析了流產(chǎn)組織染色體整倍性對移植同一取卵周期冷凍胚胎的妊娠結(jié)局的影響,比較整倍體組與非整倍體組的臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率。結(jié)果表明,兩組患者的妊娠結(jié)局無顯著差異,在排除取卵時年齡、移植胚胎數(shù)目等混雜因素后,整倍體組與非整倍體組的臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率均無顯著差異。

    自然流產(chǎn)給女性帶來巨大的心理創(chuàng)傷,其中創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)、焦慮和抑郁可持續(xù)數(shù)月,并且患者會陷入對再次流產(chǎn)的擔(dān)憂與恐懼中[5]。既往研究顯示,流產(chǎn)可增加再次流產(chǎn)及染色體異常的風(fēng)險;羊水穿刺結(jié)果表明,既往無流產(chǎn)史,染色體異常率為1.39%,若有一次流產(chǎn)史,染色體異常率為1.67%;當(dāng)發(fā)生三次流產(chǎn)后,這一數(shù)值上升到2.18%[6]。但有研究提出不同意見,即流產(chǎn)組織染色體結(jié)果與既往流產(chǎn)次數(shù)無關(guān)[7-8];年齡是影響胚胎染色體整倍性的主要因素,既往流產(chǎn)次數(shù)、活產(chǎn)次數(shù)均不影響整倍體胚胎比例[9-10]。

    胚胎非整倍體是流產(chǎn)的主要原因,占50%~60%[1]。目前,關(guān)于流產(chǎn)組織染色體非整倍性對后續(xù)妊娠結(jié)局影響的研究甚少,小樣本研究結(jié)果提示,第一次流產(chǎn)組織非整倍體與再次流產(chǎn)組織的染色體無關(guān),整倍體組與非整倍體組的妊娠結(jié)局無顯著差異[11-13]。迄今,針對非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)是否影響同一取卵周期冷凍胚胎的臨床結(jié)局,暫無相關(guān)報道。

    COH通過使用外源性促性腺激素(Gn),以期獲得適當(dāng)數(shù)量的卵母細(xì)胞,將胚胎冷凍保存用于后續(xù)移植,從而提高累積活產(chǎn)率、改善臨床結(jié)局。COH的原理是刺激原本因Gn不足而閉鎖的同一發(fā)育階段卵泡繼續(xù)發(fā)育。理論上,同一批次卵母細(xì)胞發(fā)育軌跡與發(fā)育背景類似,它們的命運(yùn)在一定程度上具有相似性。既往研究提示,卵母細(xì)胞發(fā)育異?;蛲嘶?,不能預(yù)測同一批次卵母細(xì)胞的妊娠結(jié)局[14-15],新鮮胚胎移植的結(jié)果并不影響姐妹胚胎在凍融周期的臨床結(jié)局[16]。本研究結(jié)果也提示,流產(chǎn)組織的染色體整倍性不影響凍融周期的妊娠結(jié)局,年齡與胚胎移植數(shù)目是影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險因素。因此,我們推論:同一取卵周期來源胚胎,各自發(fā)育潛能不同,是相互獨(dú)立的事件,妊娠結(jié)局主要受年齡及移植胚胎數(shù)目影響。

    目前,PGT-A已廣泛應(yīng)用于ART的相關(guān)治療。僅發(fā)生過一次染色體異常所致流產(chǎn)的患者,能否從PGT-A中獲益,目前相關(guān)研究甚少。Zhou等[17]研究的結(jié)果表明,既往有一次染色體非整倍體異常導(dǎo)致流產(chǎn)史的患者中,PGT-A組與非PGT-A組的早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率均無顯著差異,對這些患者行PGT-A臨床意義不大。本研究結(jié)果也支持這一結(jié)論,在我們研究中,流產(chǎn)組織非整倍性并不影響姐妹胚胎的妊娠結(jié)局。

    作為回顧性研究,本項工作難以避免一些局限性,例如本項工作中非整倍體組取卵時年齡顯著高于整倍體組年齡,不同患者移植次數(shù)不一樣導(dǎo)致出現(xiàn)重復(fù)數(shù)據(jù)引起的偏倚等。故此,我們采取了措施來改善研究的可信性:控制納入患者的基礎(chǔ)條件,如排除復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗患者,排除雙方或一方染色體異?;颊叩?;采用GEE糾正了重復(fù)數(shù)據(jù)所致偏倚及年齡、移植胚胎數(shù)目等混雜因素的影響;計算累積活產(chǎn)率,最大限度的反映了同一取卵周期的所有胚胎情況;本研究所有數(shù)據(jù)來自于同一中心,尤其是染色體結(jié)果判讀,有專門的人員負(fù)責(zé),減少了操作人員和技術(shù)操作相關(guān)的偏差;本項工作共納入539個周期,樣本量大,可以反映其實(shí)際狀況。因此,本研究結(jié)果具有可信度,有助于對臨床治療方案提供參考資料,給患者咨詢提供指導(dǎo)意義。

    綜上所述,非整倍體組與整倍體組比較,兩組的臨床妊娠結(jié)局無顯著差異,一次染色體非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)后,移植同一取卵周期的冷凍胚胎是安全有效的。由于本研究為單中心研究,后續(xù)還需要更多研究來證實(shí)丟棄這些姐妹胚胎或?qū)ζ湫蠵GT-A的實(shí)際臨床意義。

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