FSHR基因多態(tài)性與卵巢反應性及臨床結(jié)局的相關(guān)研究

馬卓群，楊怡卓，張蔓麗，穆莎，彭紅梅*

(1.解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心婦產(chǎn)科，北京 100853；3.中國人民解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化實驗室，北京 100853)

在輔助生殖技術(shù)(ART)應用中，控制性促排卵(COH)是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)這一復雜程序的關(guān)鍵步驟，也是獲得一定數(shù)目且高質(zhì)量卵母細胞和理想臨床妊娠率的重要前提和保障。但因個體差異難以在COH前準確預測卵巢對外源性卵泡刺激素(FSH)刺激的反應。有些患者對外源性FSH敏感性較低，導致獲卵過少，出現(xiàn)無可移植胚胎的情況，卵巢低反應患者在行助孕治療總?cè)巳褐写蠹s占9%～24%[1]。而有些患者敏感性較高，易導致卵巢過度刺激綜合征(OHSS)，只能取消新鮮周期移植，甚至出現(xiàn)腹水、胸水等癥狀[2]。因此如何在COH過程中提前預測患者的卵巢反應性，對制定個性化的治療方案十分重要。FSH由腦垂體前葉合成和分泌，主要通過與顆粒細胞膜表面的特異性FSH受體(FSHR)結(jié)合，發(fā)揮其調(diào)節(jié)蛋白表達和細胞發(fā)育的作用，以維持生殖系統(tǒng)的動態(tài)平衡。有研究表明，F(xiàn)SHR多態(tài)性可能影響基礎(chǔ)FSH(bFSH)和E2水平，F(xiàn)SHR基因和其他基因變異可能在調(diào)節(jié)受體敏感性和其他促性腺激素(Gn)方面發(fā)揮作用[3]。近年來，有研究報道，F(xiàn)SHR單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能與卵巢反應性具有一定關(guān)聯(lián)[4]。因此，本研究通過前瞻性研究，對接受IVF-ET助孕治療的不孕癥女性FSHR基因rs6165(Thr307Ala)、rs6166(Asn680Ser)位點多態(tài)性進行檢測，分析其與卵巢反應性及OHSS發(fā)生的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對象

招募2020年10月至2021年12月在中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心生殖醫(yī)學中心進行IVF-ET助孕治療的女性患者為研究對象。納入標準：(1)年齡≤38歲；(2)本取卵周期為首次取卵周期。排除標準：(1)輸卵管、卵巢手術(shù)史或結(jié)核史；(2)化療史、盆腹腔放療史；(3)既往或現(xiàn)患有影響Gn或生殖激素分泌及代謝的疾??；(4)受試前3個月內(nèi)使用藥物或口服避孕藥。

共納入551例不孕癥患者。本研究設(shè)計經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準通過(倫理審查號：S2020-374-01)，所有研究對象均同意加入本研究并充分知情同意后簽署知情同意書。

二、研究方法

1.COH：通過陰道B超監(jiān)測卵巢卵泡發(fā)育情況并結(jié)合患者bFSH、抗苗勒管激素(AMH)水平和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等各項指標制定合適的促排卵方案，如拮抗劑方案、長方案、短方案、微刺激方案等。當優(yōu)勢卵泡>18 mm、至少有3個卵泡≥16 mm時，肌肉注射HCG(珠麗海珠制藥)10 000 U。HCG注射后36 h在超聲引導下取卵。

2.IVF-ET或凍融胚胎移植(FET)：對患者病史及取卵結(jié)果進行評估后選擇IVF或ICSI人工授精，受精后16～18 h觀察受精狀態(tài)，見到雙原核(2PN)者為正常受精，則繼續(xù)體外培養(yǎng)。根據(jù)《人類體外受精-胚胎移植實驗室操作專家共識》[5]和Gardner標準[6]分別對卵裂期胚胎及囊胚進行評級。根據(jù)患者病史、獲卵數(shù)及取卵后有無OHSS發(fā)生風險等綜合判斷是否進行新鮮胚胎移植，或?qū)⒖衫门咛ゲＡЩ鋬龊髶衿谛蠪ET。所有患者均移植1～2枚卵裂期胚胎或囊胚(優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)胚胎)，新鮮移植或FET后均行常規(guī)黃體支持。

3.SNP檢測：取卵當日，抽取患者外周靜脈血5 ml保存于EDTA抗凝管中；按照DNA提取試劑盒QIAamp DNA Blood Mini Kit 51106(250)(QIAGEN，德國)說明書操作，提取血液樣本的DNA，并經(jīng)分光光度計測定其濃度及純度。使用Primer Premier 5.0軟件進行FSHR基因SNP位點rs6165(Thr307Ala)、rs6166(Asn680Ser)的引物設(shè)計，具體引物序列見表1。本實驗所需引物均由上海生工生物工程股份有限公司(北京)合成。對目的DNA片段進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，使用KOD FX Neo Polymerase試劑盒(KFX-201，TOYOBO，日本)進行實驗。經(jīng)預實驗，兩個反應可共用1個反應條件。PCR體系為50 μl，反應體系由25 μl的2×PCR buffer、10 μl dNTPs(2 mmol/L)、上/下游引物(10 μmol/ml)各1.5 μl、1 μl的DNA樣品、10 μl滅菌蒸餾水和1 μl KOD FX(1.0 U/μl)組成。擴增條件：94℃×2 min；98℃×10 s，55℃×30 s，68℃×30 s，35個循環(huán)；68℃×5 min。PCR反應完成后，使用1%的瓊脂糖膠電泳分析PCR產(chǎn)物，觀察顯影結(jié)果，拍照保存并導出圖像。目標DNA片段切膠回收，將回收純化的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司(北京)進行一代測序。測序結(jié)果返回后，通過Chromas軟件查看測序質(zhì)量和結(jié)果，并利用Mutation Surveyor 4.0.5軟件將測序結(jié)果與原序列進行比對分析，確定是否存在特異的SNP位點，并統(tǒng)計基因型。

表1 FSHR基因SNP引物

4.研究分組：根據(jù)多態(tài)性位點基因型檢測結(jié)果，將rs6165(Thr307Ala)分為A/A組(273例)、A/G組(224例)和G/G組(54例)，rs6166(Asn680Ser)亦分為A/A組(272例)、A/G組(231例)和G/G組(48例)。

5.觀察指標及判斷標準：記錄患者的一般資料[年齡、BMI、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)、AMH、bFSH、bLH水平]、促排卵及胚胎發(fā)育情況(促排天數(shù)、外源性FSH劑量、總卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、MⅡ卵母細胞數(shù)，正常受精數(shù)、正常卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、囊胚形成率)、臨床妊娠率，以及各組中卵巢反應情況和OHSS發(fā)生率。

胚胎移植后14 d行血HCG檢測，陽性者于移植后28 d行陰道超聲檢查，見宮腔內(nèi)孕囊及胎心搏動者確定為臨床妊娠。卵巢低反應指獲卵數(shù)≤4枚者，正常反應指5枚≤獲卵數(shù)≤15枚，高反應指獲卵數(shù)>15枚。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共納入551例患者，F(xiàn)SHR基因SNP位點rs6165、rs6166各等位基因與基因型的分布情況見表2。

表2 FSHR基因SNP位點rs6165、rs6166等位基因與基因型分布情況

二、rs6165(Thr307Ala)不同基因型組間比較

rs6165(Thr307Ala)3種基因型分組的患者年齡、BMI、AMH等一般資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)；3組患者的促排卵天數(shù)、外源性FSH劑量、總卵泡數(shù)、獲卵數(shù)亦無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的MⅡ卵母細胞數(shù)顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表4)；3組患者的正常卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、囊胚形成率、臨床妊娠率均無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的正常受精數(shù)顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表5)。

表3 rs6165不同基因型組別的一般資料比較(-±s)

表4 rs6165不同基因型組別促排卵情況比較(-±s)

表5 rs6165不同基因型組別的受精及胚胎發(fā)育情況比較((-±s)，%)

三、rs6166(Asn680Ser)不同基因型組間比較

rs6166(Asn680Ser)3種基因型分組的患者年齡、BMI、AMH等一般資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6)；3組患者的促排天數(shù)、外源性FSH劑量、總卵泡數(shù)、獲卵數(shù)亦無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的MⅡ卵母細胞數(shù)顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表7)；3組患者的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、囊胚形成率、臨床妊娠率均無顯著性差異(P>0.05)，A/A基因型組的正常受精數(shù)、正常卵裂數(shù)顯著高于A/G基因型組(P<0.05)(表8)。

表6 rs6166不同基因型組別的一般資料比較(-±s)

表7 rs6166不同基因型組別的促排卵情況比較(-±s)

表8 rs6166不同基因型組別的受精及胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，%]

四、FSHR基因多態(tài)性與卵巢反應性及OHSS發(fā)生的相關(guān)分析

rs6165(Thr307Ala)A/A基因型組卵巢低反應發(fā)生率顯著低于A/G基因型和G/G基因型(P<0.05)；其余基因型中不同卵巢反應性情況無顯著性差異(P>0.05)(表9)。rs6166(Asn680Ser)A/A基因型組卵巢低反應發(fā)生率亦顯著低于A/G基因型和G/G基因型(P<0.05)(表10)。在551例納入患者中，有53名患者發(fā)生OHSS，rs6165和rs6166不同基因型組別中OHSS發(fā)生率無顯著性差異(P>0.05)(表9、10)。

表9 rs6165不同基因型組別中卵巢低、中、高反應發(fā)生情況[n(%)]

表10 rs6166不同基因型組別中卵巢低、中、高反應發(fā)生情況[n(%)]

討 論

目前，通過FSH、E2、AMH等激素水平檢測及AFC等來預測卵巢反應性及獲卵數(shù)已經(jīng)成為ART過程中常規(guī)檢測的一部分[7]。近年來FSHR基因多態(tài)性與卵巢反應性的關(guān)聯(lián)逐漸被關(guān)注[8]。FSHR基因多態(tài)性評估尚不可以取代傳統(tǒng)的卵巢儲備檢測，但是與傳統(tǒng)檢測方法相比，評估個體的FSHR基因多態(tài)性可以了解甚至更好地預測某些特定或難以治療患者的卵巢反應性[9]，對制定誘導排卵的個體化方案存在潛在價值。

本研究納入的551例助孕女性中，SNP位點FSHRrs6165(Thr307Ala)A/A基因型和rs6166(Asn680Ser)A/A基因型是最常見的基因型，頻率分別為49.54%和49.36%。之前國外學者的相關(guān)研究提出，rs6165(Thr307Ala)A/G基因型和rs6166(Asn680Ser)A/G基因型是高加索人種中最常見的基因型[10-12]。提示FSHR多態(tài)性的分布差異可能與種族、地域有關(guān)。

有研究通過監(jiān)測排卵周期中垂體和卵巢激素的分泌模式，發(fā)現(xiàn)rs6165(Thr307Ala)參與人類月經(jīng)周期時長和周期的改變[13]。有文獻報道，在COH過程中，rs6165(Thr307Ala)G/G基因型的印度婦女可能更適合低劑量的FSH進行卵巢刺激，且該基因型發(fā)生OHSS的風險增加[14]。2021年一項研究提出，rs6165(Thr307Ala)A/A基因型的女性比其他基因型女性促排天數(shù)更短、所需外源性FSH劑量更少[15]，但本研究中這種差異并不明顯。在巴西開展的一項研究指出，基因多態(tài)性并不決定bFSH和E2水平以及ART治療中的卵巢反應，但rs6165(Thr307Ala)G/G基因型女性的MⅡ期卵母細胞數(shù)和胚胎數(shù)量明顯高于A/G基因型和/A/A基因型[16]。而本研究結(jié)果顯示，rs6165(Thr307Ala)A/A基因型患者MⅡ期卵母細胞數(shù)與正常受精數(shù)均顯著高于基因型A/G的患者，這可能是由于地域和人種因素導致的差別。

都在外顯子10上的兩個SNP即rs6165(Thr307Ala)與rs6166(Asn680Ser)之間有很強的連鎖性，迄今為止大多數(shù)研究都集中在rs6166(Asn680Ser)。有研究表明，rs6166(Asn680Ser)A/A基因型女性月經(jīng)周期較G/G基因型女性長2.3 d左右[17]。一項共納入4 020例婦女的薈萃分析也證明，與其他基因型相比，rs6166(Asn680Ser)A/A純合子基因型女性bFSH水平較高，并且需要更多的外源性FSH來誘導卵泡發(fā)育以達到相同的卵泡刺激效果，高基礎(chǔ)水平通常預示著卵巢對FSH反應的閾值更高[18]。關(guān)于不同基因型患者的臨床妊娠結(jié)局，有個別文獻提出rs6166(Asn680Ser)基因型與臨床妊娠結(jié)局有關(guān)，G/G純合子基因型患者的臨床妊娠率顯著高于其他基因型患者[19]。同時也有一些研究指出，rs6166(Asn680Ser)基因型與卵巢反應性[20]和累積活產(chǎn)率[21]無關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示，各組臨床妊娠率無顯著性差異(P>0.05)；結(jié)合之前的文獻分析，認為FSHR基因多態(tài)性與臨床妊娠結(jié)局之間的關(guān)系尚存在爭議，可能是由于樣本數(shù)量較少或人種、地域差異所致。且因為本研究設(shè)計時將臨床妊娠率作為重點觀察指標，故未對納入患者的胚胎移植情況及種植率、生化妊娠率等進行分析，研究數(shù)據(jù)覆蓋不夠全面，研究結(jié)論存在一定的局限性，后續(xù)還需完善研究設(shè)計、延長隨訪時間進一步加以探討。

綜上所述，F(xiàn)SHR常見SNP位點rs6165(Thr307Ala)和rs6166(Asn680Ser)的不同基因型與卵巢反應性有一定關(guān)聯(lián)，可以為臨床制定個體化的COH方案提供參考；但其對妊娠結(jié)局及OHSS發(fā)生的影響并不明顯。由于樣本數(shù)量、標志物數(shù)據(jù)標準、統(tǒng)計描述方式、人口分層、遺傳變異(遺傳異質(zhì)性，人口歷史)、環(huán)境因素等的干擾，研究結(jié)論目前尚存在爭議，將來還應考慮FSH-FSHR系統(tǒng)的遺傳復雜性，從藥物遺傳學、生理學信號轉(zhuǎn)導等角度進一步深入研究；且由于基因檢測的成本較高，該檢測方法的普及使用尚有待研究。