蛋白酶體抑制劑乳胞素對大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化損傷的作用

潘 琪,王子珍,葉富躍,邢 偉,林家漢,盧剪月,楊 堃

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?70102；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?70102）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以靜止性震顫、運動緩慢、肌強直和姿勢步態(tài)障礙為癥狀特征，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性和紋狀體內(nèi)多巴胺嚴(yán)重減少為病理學(xué)特征，其發(fā)病機制尚未完全清楚［1-2］。研 究［3］顯 示：泛 素-蛋 白酶 體 系 統(tǒng) 受 損 與PD的發(fā)生有密切關(guān)系。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞中重要的非溶酶體蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，參與細(xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解［4］。蛋白酶體抑制劑能夠誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元退變和包涵體形成，類似于PD的病理特征，但其中的機制尚未完全明確［5-6］。早期研究［7-9］顯示：氧化損傷可能是導(dǎo)致PD神經(jīng)元死亡的重要因素之一。體外研究［10］顯示：抑制蛋白酶體會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷。但相關(guān)研究較少，且體內(nèi)抑制蛋白酶體對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的氧化損傷作用尚不明確。本研究采用立體定向手術(shù)將蛋白酶體抑制劑乳胞素注射入大鼠黑質(zhì)中，于注射后不同時間點檢測大鼠中腦黑質(zhì)中的羥自由基、還原型谷 胱 甘 肽 （glutathione， GSH）、 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白質(zhì)羰基和8-羥基脫 氧 鳥 苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）等氧化損傷指標(biāo)及黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元退變情況，探討體內(nèi)氧化損傷在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元死亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器健康雄性SD大鼠70只由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（瓊）2017-0013，體質(zhì)量200～250 g，室溫22℃±2℃，光線12 h明暗交替，自由飲水飲食。所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求。乳胞素、小鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）單克隆抗體和阿撲嗎啡購自美國Sigma公司，免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（SP-9002）和DAB顯色試劑盒（ZLI-9032）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，羥自由基測試試劑盒、GSH測定試劑盒、MDA測定試劑盒、蛋白質(zhì)羰基水平測定試劑盒和8-OHdG測試盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠立體定向儀（51603型）購自美國Stoelting公司，圖像分析系統(tǒng)（NIKON 801圖像分析系統(tǒng)）購自日本尼康公司，冰凍切片機（CM 1900）購自德國Leica公司，酶標(biāo)儀（Synergy H 1M）購自美國Bio-Tek公司。

1.2 動物分組和黑質(zhì)乳胞素注射將70只SD大鼠隨機分為乳胞素組和生理鹽水組，每組35只，經(jīng)反復(fù)行為檢測確認(rèn)其無旋轉(zhuǎn)行為后進行實驗。3.5%水合氯醛（350 mg·kg－1）腹腔注射麻醉動物后固定在立體定向儀上，齒桿較耳桿低2.4 mm，確定各組大鼠右側(cè)黑質(zhì)致密部為前囟后5.2 mm，矢狀縫右側(cè)2.2 mm，硬膜下7.2 mm，切開顱部皮膚，小型磨鉆鉆開顱骨，按已確定的坐標(biāo)將微量注射器緩慢進針至預(yù)定深度，注射2μL乳胞素10μg（生理鹽水溶解），注射速度為0.5μL·min－1，留針5 min，緩慢退針，縫合切口。生理鹽水組大鼠按照相同方法注射等體積的生理鹽水。

1.3 曠場實驗檢測2組大鼠運動能力干預(yù)后21 d行曠場實驗檢測2組大鼠運動能力［11］。曠場實驗箱：黑色敞口木箱，大小為60 cm×60 cm×40 cm，箱底劃為25個方格（12 cm×12 cm），將大鼠置入正中一格，10 s后開始記錄15 min內(nèi)2組大鼠各項行為指標(biāo)?？偱軇訒r間：大鼠軀干處于水平位置時向前后或兩側(cè)運動的時間；下肢站立次數(shù)：雙前肢抬起離地1 cm以上的次數(shù)；穿梭距離：規(guī)定時間內(nèi)跑動的格子數(shù)（二爪以上跨入鄰格為跑動1格）；實驗在17：00～22：00進行，實驗室內(nèi)暗光、安靜，2次實驗之間將箱底打掃干凈。

1.4 不對稱實驗檢查大鼠行為能力將大鼠置入透明塑料圓柱筒（直徑20 cm，高30 cm）中，錄像記錄大鼠在筒內(nèi)的行為。測試時間為10 min。在暗光環(huán)境下進行測試［12］。測試完成后，由不了解大鼠狀況的研究人員通過錄像對大鼠行為進行記分和評分。評分方法為計算不對稱指數(shù)，不對稱指數(shù)=（同側(cè)觸壁次數(shù)+1/2雙側(cè)觸壁次數(shù)）/（同側(cè)觸壁次數(shù)+對側(cè)觸壁次數(shù)+雙側(cè)觸壁次數(shù)）。

1.5 阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗檢測各組大鼠運動行為曠場實驗后進行阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗［13］。大鼠皮下注射阿撲嗎啡（0.25 mg·kg－1）后置于圓形測試容器中，10 min后開始觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改變，記錄30 min內(nèi)大鼠的對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.6 黑質(zhì)氧化損傷指標(biāo)檢測干預(yù)后第3、7和21 d，采用8%水合氯醛（400 mg·kg－1）對大鼠進行深度麻醉，快速斷頭取腦，在冰臺上分離出新鮮黑質(zhì)，采用4℃PBS沖洗除去殘余血液，在干冰上用濾紙拭干，立即置于－80℃超低溫冰箱備用。取組織塊采用4℃PBS漂洗，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，采用眼科剪快速剪碎組織塊，按質(zhì)量（g）：體積（mL）=1∶9的比例，加入4℃預(yù)冷的生理鹽水中，組織勻漿器充分勻漿，3 000 r·min－1、4℃離心15 min，將離心好的勻漿取上清棄去下面沉淀。羥自由基、GSH、MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHd G水平檢測的具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.7 黑質(zhì)TH免疫組織化學(xué)染色和神經(jīng)元計數(shù)干預(yù)后 21 d，8% 水合氯醛深度麻醉（400 mg·kg－1）大鼠，然后將大鼠固定于實驗板上。充分暴露心臟，持針頭刺入左心室，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，300 mL/只，將灌注液更換為4%多聚甲醛400 mL。斷頭取腦，采用4%多聚甲醛后固定6 h。冰凍切片，片厚30μm。按免疫組織化學(xué)檢測工作液試劑盒說明行TH免疫組織化學(xué)染色。小鼠抗TH一抗稀釋比例為1∶1 000。每只大鼠取前囟后－4.8 mm、－5.2 mm和－5.6 mm的切片各1張，共3張切片，然后對兩側(cè)黑質(zhì)的TH免疫陽性神經(jīng)元進行計數(shù)。黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元毀損程度采用黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元殘存率表示，殘存率越低，毀損程度越高。每只大鼠黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元殘存率為毀損側(cè)與健側(cè)的TH免疫陽性神經(jīng)元百分率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。2組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、穿梭距離、下肢站立的次數(shù)、總跑動時間和羥自由基、GSH、MDA、蛋白質(zhì)羰基及8-OHdG水平分布符合正態(tài)分布，以±s表示，組間兩兩比較采用LSDt法。2組大鼠不對稱指數(shù)和神經(jīng)元殘存率以±s表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 曠場實驗檢測2組大鼠運動能力干預(yù)21 d后，乳胞素組大鼠跑動減少、運動緩慢，穿梭距離明顯低于生理鹽水組（P＜0.05）。乳胞素組大鼠15 min內(nèi)下肢站立次數(shù)與生理鹽水組比較亦明顯減少（P＜0.05）。生理鹽水組大鼠跑動活躍，平均有近一半的時間均在跑動，而乳胞素組大鼠跑動較少，總跑動時間較生理鹽水組減少（P＜0.05）。見表1。

表1 2組大鼠曠場實驗相關(guān)指標(biāo)Tab.1 Indicators of open field test of rats in two groups

2.2 2組大鼠行為能力干預(yù)21 d后，生理鹽水組大鼠前肢使用不對稱指數(shù)為0.51，位于0.5附近，表明大鼠對兩側(cè)前肢的使用無偏好。乳胞素組大鼠前肢使用不對稱指數(shù)為0.81，明顯大于0.5，表明大鼠偏好使用毀損同側(cè)肢體。與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠前肢使用不對稱指數(shù)明顯升高（t=－11.155，P＜0.05）。

2.3 2組大鼠旋轉(zhuǎn)行為表現(xiàn)干預(yù)21 d后，乳胞素組大鼠注射阿撲嗎啡后出現(xiàn)恒向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為以健側(cè)后肢為支撐點，頭尾相接，身體彎曲成環(huán)狀的快速旋轉(zhuǎn)行為。第3、7和21天30 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為（17.9±11.3）、（27.6±18.8）和（260.4±22.2）圈，與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），第21天大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較前2次（第3天和第7天時）的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯增多（P＜0.05），而第7天大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與第3天的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.239）。生理鹽水組大鼠注射阿撲嗎啡后無旋轉(zhuǎn)行為。

2.4 2組大鼠黑質(zhì)氧化損傷指標(biāo)干預(yù)7和21 d后，與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠右側(cè)黑質(zhì)中羥自由基水平明顯升高（P＜0.05），而GSH水平明顯降低（P＜0.05）。干預(yù)7和21 d后，與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠右側(cè)黑質(zhì)中MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHd G水平明顯升高（P＜0.05）。干預(yù)3 d后，2組大鼠右側(cè)黑質(zhì)中羥自由基、GSH、MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHd G水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和3。

表2 不同時間點2組大鼠右側(cè)黑質(zhì)中羥自由基和GSH水平Tab.2 Levels of hydroxyl radical and GSH in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

表2 不同時間點2組大鼠右側(cè)黑質(zhì)中羥自由基和GSH水平Tab.2 Levels of hydroxyl radical and GSH in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group.

表3 不同時間點2組大鼠右側(cè)黑質(zhì)中MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHd G水平Tab.3 Levels of MDA,protein carbonyl and 8-OHdG in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

表3 不同時間點2組大鼠右側(cè)黑質(zhì)中MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHd G水平Tab.3 Levels of MDA,protein carbonyl and 8-OHdG in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group.

2.5 2組大鼠黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元殘存率干預(yù)21 d后，生理鹽水組大鼠兩側(cè)黑質(zhì)中均有大量的TH免疫陽性神經(jīng)元。乳胞素組大鼠毀損側(cè)（右側(cè)）黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元明顯喪失。生理鹽水組和乳胞素組大鼠黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元殘存率分別為（98.48%±3.16%）和（10.91%±1.77%）。與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元殘存率明顯降低（t=59.263，P＜0.05）。乳胞素組大鼠毀損側(cè)黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)較對側(cè)平均減少約89.09%。見圖1。

圖1 2組大鼠黑質(zhì)中TH免疫組織化學(xué)染色情況（Bar=1 mm）Fig.1 TH immunohistochemical staining in substantia nigra of rats in two groups(Bar=1 mm)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：將蛋白酶體抑制劑乳胞素注射入大鼠黑質(zhì)后，黑質(zhì)中羥自由基、MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHd G水平明顯升高，而GSH水平明顯降低。組織中羥自由基和GSH水平是反映組織氧化還原狀態(tài)的常用標(biāo)志物［14-15］。大鼠黑質(zhì)中注射乳胞素后第7和21天，黑質(zhì)中羥自由基水平明顯升高，而GSH水平明顯降低，表明乳胞素誘導(dǎo)大鼠黑質(zhì)組織出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHdG分別是脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷的常用生物標(biāo)志物［16-17］。大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射乳胞素后第7和21天，MDA、蛋白質(zhì)羰基和8-OHd G水平均出現(xiàn)明顯升高，表明乳胞素誘導(dǎo)黑質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA均出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化損傷。這些發(fā)現(xiàn)與先前的多項體外研究結(jié)果一致。抑制蛋白酶體可以導(dǎo)致NT-2細(xì)胞和SK-N-MC細(xì)胞氧化損傷，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的氧化損傷水平升高及GSH水平降低［18］。有研究［19］顯示：抑制蛋白酶體可引起神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的DNA和RNA的氧化損傷。有研究［18］顯示：蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的氧化損傷早于細(xì)胞死亡，提示蛋白酶體抑制劑通過誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化損傷的機制尚不完全明確，可能與氧化損傷的蛋白質(zhì)降解減少、線粒體功能受損和鐵離子失穩(wěn)態(tài)等有關(guān)［20-21］，還需要進一步研究。本研究中，在注射乳胞素第3天時大鼠黑質(zhì)組織中未檢測出氧化應(yīng)激標(biāo)志物的明顯改變，提示體內(nèi)抑制蛋白酶體誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化損傷需要較長的時間。

本研究結(jié)果顯示：2μL、5 g·L－1蛋白酶體抑制劑乳胞素單側(cè)黑質(zhì)內(nèi)微量注射可以導(dǎo)致大鼠黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元大量喪失。TH是多巴胺能神經(jīng)元的常用標(biāo)志物，黑質(zhì)中TH免疫陽性神經(jīng)元大量喪失反映出黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元大量死亡。乳胞素組大鼠毀損側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)較對側(cè)平均減少約89.09%，表明2μL、5 g·L－1乳胞素單側(cè)黑質(zhì)內(nèi)注射可以達(dá)到嚴(yán)重毀損一側(cè)黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路。乳胞素組大鼠在曠場測試中表現(xiàn)出明顯的運動減少和運動緩慢癥狀，在前肢采用不對稱測試中偏好使用毀損同側(cè)肢體，在阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗中注射阿撲嗎啡后出現(xiàn)恒向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，表明這些類似于PD的運動障礙表現(xiàn)能夠被相關(guān)行為學(xué)測試檢測出。以上研究結(jié)果支持蛋白酶體抑制劑可以用于PD動物模型的建立。

綜上所述，大鼠黑質(zhì)中注射蛋白酶體抑制劑可以誘導(dǎo)大鼠多巴胺能神經(jīng)元氧化損傷和死亡，大鼠能夠表現(xiàn)出類似于PD的運動障礙表現(xiàn)，氧化損傷在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元死亡中起重要作用。