食品加工機(jī)械材料橡膠密封墊圈中5種熒光增白劑遷移量的測定及其遷移規(guī)律研究

候德莉，徐 莉，梁振綱，戴小麗，吳毓浪

（?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心，海南 ?？?570311）

熒光增白劑（Fluorescent whitening agents，F(xiàn)WAs），亦稱為白色染料，是一類能夠吸收不可見紫外光，進(jìn)而激發(fā)出可見藍(lán)色或藍(lán)紫色熒光的復(fù)雜有機(jī)化合物［1-3］。近年來，隨著食品安全問題日漸突出，熒光增白劑的危害以及其向食品遷移的情況逐漸引起人們的重視。橡膠是制作密封墊圈最常見的材料之一，具有較好的綜合機(jī)械性能、高度化學(xué)穩(wěn)定和耐磨性等優(yōu)勢，在食品加工機(jī)械材料中應(yīng)用廣泛。但市場上不少商家在生產(chǎn)橡膠墊圈時(shí)使用劣質(zhì)材料或回收材料以次充好，并通過非法添加熒光增白劑提高產(chǎn)品的艷度和白度，從而削減成本、增大利潤。在食品加工過程中，受接觸食品的種類、濃度、溫度以及接觸時(shí)間等因素的影響，橡膠墊圈中的熒光增白劑易滲透遷移到食品中，進(jìn)而隨食物進(jìn)入人體，在體內(nèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易分解，可在肝臟和其他重要器官蓄積從而造成器官損壞甚至致癌［4-7］。因此，世界各國對食品接觸材料中熒光增白劑的含量均有明確限制［8-11］，如我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 9685-2016規(guī)定FWA184和FWA393的特定遷移限量（SML）分別為0.6 mg/kg和0.05 mg/kg，歐盟法規(guī)2002/72/EC 規(guī)定FWA184 的SML 為0.6 mg/kg，美國聯(lián)邦法規(guī)則規(guī)定FWA184 的加入量不得超過0.015%等，但都缺少配套的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

目前，熒光增白劑接觸安全性的研究主要集中在紙張［12］、塑料制品［13-14］、化妝品［15-17］和紡織品［18］等基質(zhì)，相關(guān)檢測方法主要有紫外燈法［19］、分光光度法［20-21］、高效液相色譜法［22］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［23-24］等，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力和質(zhì)譜高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，在食品分析中應(yīng)用廣泛。但對食品加工機(jī)械材料橡膠密封墊圈中熒光增白劑的檢測以及遷移規(guī)律的研究鮮有報(bào)道。因此，本文選取食品加工機(jī)械材料橡膠密封墊圈為基質(zhì)，以FWA184、FWA185、FWA367、FWA135、FWA393為研究對象，建立了上述5種熒光增白劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，并在可預(yù)見的使用情形下選擇最嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)條件，探索5 種熒光增白劑向橄欖油模擬物的遷移規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC H-Class高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API 4000 Q三重四極桿質(zhì)譜儀（美國ABI公司），配有電噴霧離子源；Harvard II 針泵（美國Varian 公司）；DMV-16旋渦混勻器（廣東科寅公司）；Centrifuge 5810 R 離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器（常州澳華儀器公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海錦屏公司）；G-285電子天平（瑞士Mettler公司）。

FWA184 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%，CAS：7128-64-5），F(xiàn)WA185 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.6%，CAS：2866-43-5），F(xiàn)WA393 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥96.6%，CAS：1533-45-5），F(xiàn)WA367 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.3%，CAS：5089-22-5），F(xiàn)WA135標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.9%，CAS：1041-00-5）購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈、丙酮、二氯甲烷（色譜純，美國Tedia 公司）；甲酸（色譜純，德國Merck 公司）、冰乙酸（分析純，美國Fisher Scientific 公司）、無水乙醇（優(yōu)級純，科密歐公司）；橄欖油（化學(xué)純，麥克林公司）；三元乙丙橡膠（牌號EPDM 6470，德國Lanxess 化學(xué)公司產(chǎn)品）；超純水由實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制備；C18、PLS、AL-N、PSA、PH、GCB凈化劑（迪馬科技公司）；微孔濾膜（0.22 μm，有機(jī)系）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）：各稱取5種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg），分別用丙酮溶解并定容至10 mL，于4 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）：分別吸取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用丙酮定容至10 mL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3 色譜條件

色譜柱：資生堂MGⅡC18（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃。流動相：A 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈，梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%～60% A；1.0～3.0 min，60%～10% A；3.0～11.0 min，10%A；11.0～12.0 min，10%～90%A；12.0～14.0 min，90%A。流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子掃描（ESI+）；離子源電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮?dú)狻? 種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過針泵流動注射直接進(jìn)樣，一級質(zhì)譜全掃描確定化合物母離子，對母離子碰撞后進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到碎片離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

表1 MRM模式下5種熒光增白劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of 5 fluorescent whitening agents under MRM mode

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 樣品制備取5 種待測組分各5 g 加至1 kg 三元乙丙橡膠中，經(jīng)硫化后得到特制陽性樣品（食品級）。

1.5.2 食品模擬物的選取依據(jù)GB 5009.156-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)預(yù)處理方法通則》［25］和GB 31604.1-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》［26］要求，選取水、4%乙酸水溶液、50%乙醇水溶液、橄欖油4 種食品模擬物分別代表水基非酸性食品、水基酸性食品、酒精類食品和油基食品進(jìn)行遷移試驗(yàn)。

1.5.3 提取水基性和酒精性食品模擬物經(jīng)遷移試驗(yàn)處理后，準(zhǔn)確稱取5.0 g（精確至0.001 g）于10 mL比色管中，以流動相定容至刻度，混勻后取1 mL至進(jìn)樣瓶，待測；橄欖油食品模擬物基質(zhì)復(fù)雜，對熒光增白劑附著度高，試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取1.0 g（精確至0.001 g）橄欖油模擬物于玻璃離心管中，加入10 mL丙酮溶解，渦旋3 min，取1 mL樣液，加入50 mg C18粉末凈化，渦旋離心后，取上清液過微孔濾膜，進(jìn)LC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于FWAs 極性小、易溶于油脂中與油深度結(jié)合，采用甲醇、甲醇水、乙腈等有機(jī)溶劑均無法將待測組分有效萃?。恍O性溶劑如正己烷、乙酸乙酯與流動相不互溶，不適合作為提取溶劑。橄欖油和待測組分可有效溶解于丙酮、二氯甲烷中，本文嘗試以兩者為提取溶劑，直接將橄欖油樣品溶解后萃取。結(jié)果表明，二氯甲烷作為提取溶劑時(shí)對FWA367、FWA393、FWA184無回收，丙酮對5種FWAs均有較好的提取效果，因此采用丙酮作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

丙酮提取后的樣液直接進(jìn)LC-MS/MS檢測，結(jié)果顯示FWA185、FWA184、FWA135有極強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?？紤]到丙酮作為溶劑不適合采用反相吸附的固相萃取小柱凈化，本文通過分散固相萃取法，正相吸附提取溶劑中的基質(zhì)干擾物，分別考察了PLS、Al-N、PH、C18、PSA、GCB 6種凈化劑的凈化效果。結(jié)果表明，PLS、PSA 和Al-N 對FWA367 有吸附作用，回收率低于60%；PH 無法清除FWA184的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，回收率大于150%；使用GCB 凈化時(shí)，F(xiàn)WA184 回收率低于80%，其余組分回收率均低于10%；而C18作為凈化劑時(shí)，所有組分的回收率均在80%～110%范圍，故采用C18作為凈化劑。不同凈化方式在0.05 mg/kg加標(biāo)水平的回收率見圖1。

圖1 不同凈化方式在0.05 mg/kg加標(biāo)水平的回收率Fig.1 Recovery under different purification methods at 0.05 mg/kg spiked level

2.3 流動相選擇

分別考察了乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol/L 乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸（10 mmol/L 乙酸銨）溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-10 mmol/L 乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸（10 mmol/L 乙酸銨）溶液6 種流動相體系對峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，乙酸銨作為流動相會抑制FWA393 的響應(yīng)，而甲酸的加入能夠促進(jìn)化合物離子化，使響應(yīng)值增高；乙腈-0.1%甲酸溶液體系相對甲醇-0.1%甲酸溶液體系洗脫效果好，且體系壓力低，能夠有效保護(hù)儀器和延長色譜柱使用壽命，故采用乙腈-0.1%甲酸溶液體系作為流動相。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系及定量下限

基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度存在重要影響［27］，本文采用相對響應(yīng)值法（基質(zhì)中待測組分響應(yīng)/純?nèi)軇┲写郎y組分響應(yīng)× 100%）［28］考察5 種FWAs 在橄欖油食品模擬物中的基質(zhì)效應(yīng)。將3組陰性橄欖油基質(zhì)在優(yōu)化條件下進(jìn)行提取和凈化，用凈化后的基質(zhì)樣液配制50 ng/mL 的5 種FWAs 混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別以3 組響應(yīng)值結(jié)果的平均值與純?nèi)軇┡渲频?0 ng/mL 的5 種FWAs混合標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值進(jìn)行比較評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，經(jīng)C18凈化后，5種FWAs在橄欖油食品模擬物中的相對響應(yīng)值均在80%～100%范圍內(nèi)，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)，可直接采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成5、10、20、50、80、100 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下依次進(jìn)樣分析，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，5種FWAs在5～100 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 1。根據(jù)10倍信噪比并計(jì)入試樣量和定容體積，計(jì)算定量下限（LOQ）。得到5種FWAs在水模擬物中的定量下限為0.001～0.003 mg/kg，在3%乙酸模擬物中的定量下限為0.002～0.003 mg/kg，在50%乙醇中的定量下限為0.001～0.005 mg/kg，在橄欖油模擬物中的定量下限為0.008～0.050 mg/kg。

2.5 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

以空白橄欖油食品模擬物為基質(zhì)，對其進(jìn)行3個(gè)水平（0.05、0.1、0.5 mg/kg）10個(gè)平行的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，考察方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。方法的平均回收率為81.8%～101%，RSD 為1.2%～5.6%，結(jié)果見表2。

表2 橄欖油中5種熒光增白劑的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）Table 2 Recoveries and RSDs of 5 fluorescent whitening agents in olive oil（n=10）

2.6 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用本方法對市售4 種材質(zhì)（丁腈橡膠、硅橡膠、三元乙丙橡膠、氟橡膠）橡膠密封墊圈樣品進(jìn)行測定，所選樣品均標(biāo)注食品級。以橄欖油模擬物為浸泡液，70 ℃條件下浸泡24 h，所得食品模擬物按照“1.5.3”方法處理后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析。結(jié)果在丁腈橡膠材質(zhì)樣品的橄欖油模擬物中檢出FWA184，遷移量為26.6 μg/L，換算為特定遷移量為0.19 mg/kg，未超過GB 9685-2016［8］規(guī)定的FWA184 特定遷移限量（SML）（0.6 mg/kg）的要求。其余3 種材質(zhì)樣品的橄欖油模擬物中均未檢出5種熒光增白劑。

3 遷移規(guī)律研究

3.1 食品模擬物對遷移量的影響

按照GB 31604.1-2015 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》［26］和GB 5009.156-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)預(yù)處理方法通則》［25］要求，測定了特制陽性樣品中5種熒光增白劑在超純水、4%乙酸溶液、50%乙醇溶液和橄欖油模擬物中于70 ℃條件下浸泡30 h的遷移情況，每種模擬物平行測定6次，取其平均值，結(jié)果見表3。

表3 不同模擬物中熒光增白劑遷移量檢測結(jié)果Table 3 Migration of 5 fluorescent whitening agents into 4 kinds of stimulants

結(jié)果表明，5 種熒光增白劑在超純水和4%乙酸水溶液中未發(fā)生遷移；在50%乙醇水溶液中僅FWA367、FWA185 和FWA184 有 少 量 遷 移，遷 移 量 分 別 為5.22、1.04、7.21 mg/L，F(xiàn)WA393、FWA135未檢出；在橄欖油模擬物中，5種熒光增白劑均有不同程度遷移，遷移量遠(yuǎn)大于其他模擬遷移物，其中，F(xiàn)WA184和FWA185的遷移量接近陽性樣品制備時(shí)的添加量。原因可能與5種熒光增白劑的脂溶屬性有關(guān)：本研究選取的5 種熒光增白劑均為含有苯并唑共軛體系的脂溶性化合物，更易溶于橄欖油。因此，后續(xù)影響因素的考察使用橄欖油作為食品模擬物。

3.2 溫度對遷移量的影響

選用橄欖油作為食品模擬物，浸泡時(shí)間為2 h，考察了橡膠密封墊圈中5 種熒光增白劑在5、20、40、70、100 ℃條件下的遷移量變化情況。結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，橡膠密封墊圈中5種熒光增白劑的遷移量隨溫度的升高而增加。在5～40 ℃條件下，遷移量處在較低濃度水平，增長趨勢接近且變化較??；當(dāng)溫度高于40 ℃后，除FWA135 外，其余4 種熒光增白劑的遷移量明顯增加，且隨著溫度升高遷移量增幅變大；在100 ℃條件下，5 種熒光增白劑均快速遷出，其中FWA184 遷移量接近陽性樣品的制備添加量。這可能是由于溫度升高，材料內(nèi)部分子活化能增大，高分子鏈段構(gòu)象改變形成內(nèi)部空間，促使小分子發(fā)生躍遷，加快了物質(zhì)從材料向模擬物的遷移。

圖2 溫度對5種熒光增白劑遷移量的影響Fig.2 Effect of contact temperature on migration of 5 fluorescent whitening agents

3.3 時(shí)間對遷移量的影響

在40 ℃和70 ℃溫度條件下，考察了密封橡膠墊圈中5種熒光增白劑在橄欖油模擬物中的遷移量隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果見圖3。由圖3 可以看出，在兩種遷移溫度下，5 種熒光增白劑的遷移量在前10 h 均快速增大，隨后遷移速率減緩直至趨于平衡，其中FWA135 和FWA393 始終處于低遷移狀態(tài)。與40 ℃相比，70 ℃下的遷移量和遷移速率增大，除FWA135 和FWA393 外，其余3 種熒光增白劑的時(shí)間釋放曲線類似。70 ℃條件下，5 種熒光增白劑達(dá)到最大遷移量的時(shí)間為24 h，40 ℃條件下達(dá)到最大遷移量時(shí)間為120 h。這可能是因?yàn)闇囟壬?，加劇了材料中的分子運(yùn)動，使成品表層殘留的熒光增白劑更容易遷移釋放，表現(xiàn)為快速遷移釋放過程；而在40 ℃條件下，熒光增白劑需要充分浸泡才能通過橡膠密封墊圈材料的致密結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為緩慢遷移釋放過程。

圖3 40 ℃（A）和70 ℃（B）條件下時(shí)間對熒光增白劑遷移量的影響Fig.3 Effect of time on migration of 5 fluorescent whitening agents at 40 ℃（A）and 70 ℃（B）

4 結(jié) 論

本文建立了食品加工機(jī)械材料橡膠密封墊圈中5 種FWAs 遷移量的LC-MS/MS 檢測方法。采用丙酮萃取，C18吸附凈化。結(jié)果表明，該方法快速準(zhǔn)確、選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好，回收率、精確度和準(zhǔn)確度均能夠滿足食品加工機(jī)械材料橡膠密封墊圈中5 種熒光增白劑特定遷移量的測定要求。同時(shí)，研究了模擬物、遷移溫度、遷移時(shí)間對遷移規(guī)律的影響。結(jié)果表明，5種FWAs在油基類食品模擬物中遷移能力最強(qiáng)，遷移量隨遷移溫度的升高不斷增加，隨遷移時(shí)間的延長呈現(xiàn)先快速增長隨后趨于平衡的規(guī)律。由此可見，在食品機(jī)械化加工過程中，含橡膠密封墊圈接口的管路對盛裝含油脂類的食品存在一定風(fēng)險(xiǎn)，生產(chǎn)企業(yè)在食品生產(chǎn)加工過程中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的機(jī)械材料，保證消費(fèi)者身體健康。