固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中氨苯砜及其代謝物殘留量

伍 姿，黃冬梅，婁曉祎，鄭 蓉，湯云瑜，張 璇，張 俊

（1.中國水產(chǎn)科學研究院 東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（上海） 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室（上海），上海 200090；2.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；3.鈦和檢測認證集團股份有限公司，上海 200060）

目前國內(nèi)外有關(guān)動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留的研究主要集中在對蜂蜜、牛奶、雞肉、豬牛肉、魚肉等樣品的檢測［9-13］。除魚肉以外的其他水產(chǎn)品如蝦、蟹、貝類等樣品中氨苯砜及其代謝物殘留的準確測定方法未見報道，相應(yīng)的用于水產(chǎn)品殘留檢測的標準方法更是空白。目前對于氨苯砜及其代謝物殘留量測定的方法主要有超高效液相色譜法（HPLC）［15-19］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）［9-11，13，20-25］、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［26-27］、膠體金免疫層析法（GCIC）［28］、化學發(fā)光分析法（CLA）［29］等。HPLC 法多用于對氨苯砜藥物含量的測定，且靈敏度低，存在基質(zhì)干擾樣品的定性；ELISA 和GCIC法操作簡便、檢測成本低，但穩(wěn)定性較差，定量不夠準確；CLA法的研究尚不成熟，檢測器和發(fā)光材料的制備較為復(fù)雜；HPLC-MS/MS法的靈敏度高、特異性強，可通過質(zhì)譜提供更多的結(jié)構(gòu)信息，進一步提高檢測的準確性［14］。

本研究通過對提取試劑、凈化條件等前處理方法以及液相色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化，采用同位素內(nèi)標和空白基質(zhì)標準曲線定量，建立了同時檢測水產(chǎn)品中氨苯砜及其代謝產(chǎn)物殘留量的高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測法。該方法的凈化效果好，分析靈敏度高，檢出限達0.1 μg/kg，準確度和精密度均能滿足水產(chǎn)品中禁用獸藥殘留的檢測要求，為進一步研究水產(chǎn)品中氨苯砜殘留檢測標準的修訂提供了技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（ABSCIEX 5500，美國ABSCIEX 公司）；高通量組織研磨儀（上海萬柏生物有限公司）；MTS 240C 渦旋振蕩器（德國IKA 公司）；KQ-300E 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；CF16RⅫ高速冷凍離心機（日本日立公司）；Visiprep 24 管防交叉污染型（DL）固相萃取裝置（美國Supelco 公司）；N-EVAP-112 氮吹儀（美國Organomation 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，美國Tedia 公司）；氨水、鹽酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氨苯砜、N-乙酰氨苯砜、D8-氨苯砜標準品（純度大于98%，加拿大TRC 公司）。實驗用水為電阻率＞18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取標準品適量并用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的氨苯砜、N-乙酰氨苯砜和D8-氨苯砜單標儲備液，于-18 ℃冰箱冷凍避光保存。將氨苯砜和N-乙酰氨苯砜單標儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 的混合標準中間液，同樣將D8-氨苯砜儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的內(nèi)標工作液，于-18 ℃冰箱冷凍避光保存。用空白基質(zhì)提取液配成系列梯度濃度的基質(zhì)混合標準工作液，于4 ℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品采集及前處理

1.3.1 樣品制備檢測樣品：魚，去鱗，沿脊背取肌肉；蝦，去殼去頭，去腸腺（大型蝦）后取肌肉部分；蟹，洗凈去殼，取肌肉及生殖腺等可食部分；貝，洗凈去殼，取可食部位。分別絞碎，均質(zhì)混勻后裝入密封袋中并貼好標簽，于-18 ℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取準確稱量樣品2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL 具塞離心管中，準確加入內(nèi)標工作液10 μL，靜置后，再加入10 mL 1%氨化乙腈溶液振蕩萃取30 s，以2 500 r/min 旋渦混合2 min，超聲5 min，以8 000 r/min高速冷凍離心10 min，取上清液于另一干凈的離心管，待凈化。

1.3.3 凈化加入5 mL 正己烷，渦旋混合2 min，冷凍高速離心5 min，棄去正己烷層，剩余液體于45 ℃氮吹濃縮至1 mL以下，用乙腈定容至1 mL并加入9 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，混勻后過MCX固相萃取柱。MCX柱依次用6 mL甲醇，6 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液活化，備用液過柱后，保持1秒1滴的流速，然后依次用6 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液和6 mL甲醇淋洗，抽干，用6 mL 6%氨化乙腈洗脫，洗脫液于45 ℃氮吹濃縮至約0.2 mL，用10%甲醇溶液定容至1 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾，供HPLC-MS/MS進樣分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18柱（2.0 mm×100 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相A：水；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：0 ～1.5 min，15%～45%B；1.5 ～3 min，45%B；3 ～4 min，45%～90%B；4 ～5 min，90%B；5 ～5.2 min，90%～15%B；5.2 ～6 min，15%B；進樣量：5 μL。

變極發(fā)電雖然不需要增加其他設(shè)備，但由于電機的極數(shù)增加，使得電機體積明顯加大，不但制造成本大大增加，而且電機的效率也會降低。據(jù)測算，抽水運行時，雙速電機比單速電機的效率低2%左右。在低水頭情況下，變極發(fā)電比同轉(zhuǎn)速效率高得多，而在1969年江都三站建站時，變頻技術(shù)還很不成熟，只有采用變極方式。在現(xiàn)有技術(shù)條件下，因泵站的抽水時間遠大于發(fā)電時間，以降低抽水效率達到發(fā)電的目的是不經(jīng)濟的，故一般不采用變極發(fā)電方式。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；氣簾氣（CUR）壓力：207 kPa；離子噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣壓力：345 kPa；輔助氣壓力：345 kPa；碰撞氣：Medium（N2）；氨苯砜、N-乙酰氨苯砜、D8-氨苯砜的保留時間、監(jiān)測離子對、去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用50%甲醇水溶液將氨苯砜、N-乙酰氨苯砜和D8-氨苯砜標準儲備溶液稀釋至質(zhì)量濃度為100 ng/mL的標準溶液，通過蠕動泵以針泵注射、恒流進樣方式分別注入質(zhì)譜儀，流速為10 μL/min。首先在正離子模式下進行一級質(zhì)譜掃描（Q1 scan），確定目標化合物的母離子質(zhì)量數(shù)及其分子離子峰。確定母離子后，通過碎片離子掃描（Product ion scan）獲得用于定性和定量的離子碎片。選擇干擾小、響應(yīng)值強的離子對，以響應(yīng)值最強的碎片離子作為定量離子，次強碎片離子作為定性離子。建立合適的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子對通道后，通過優(yōu)化獲得子離子的去簇電壓和碰撞能量等最佳質(zhì)譜參數(shù)，以得到最終的質(zhì)譜方法。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的確定

氨苯砜及其代謝產(chǎn)物N-乙酰氨苯砜的分子結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)和氨基，而氨基在水中易發(fā)生解離。通常，以硅膠作為基質(zhì)的常規(guī)色譜柱，其表面殘留的硅醇基團和金屬雜質(zhì)會影響對堿性化合物的分析，導致出現(xiàn)不同程度的色譜峰拖尾和吸附等現(xiàn)象［23，30］。本實驗采用高純度硅膠且通過致密聚合物包被處理的CAPCELL PAK C18柱進行分離試驗，可得到對稱性良好、峰形尖銳的色譜峰。此外，氨苯砜為弱堿性化合物，極性較小，低濃度情況下酸和鹽均對其離子化產(chǎn)生強烈的抑制作用［23］。實驗選用甲醇和水作為流動相，可實現(xiàn)其充分離子化，再通過調(diào)整甲醇比例和梯度洗脫條件，可使目標化合物獲得良好分離。陰性草魚基質(zhì)加標的總離子流圖見圖1。

2.3 提取溶劑的選擇

本研究中氨苯砜和N-乙酰氨苯砜均為極性范圍較窄的化合物，幾乎不溶于水，可選擇有機試劑對其進行提取。分別考察了甲醇、乙腈、1%氨化乙腈、1%酸化乙腈和80%乙腈溶液作為提取溶劑時的提取效果，結(jié)果見圖2。研究表明，甲醇提取時由于其極性較強，樣品容易結(jié)塊，提取的雜質(zhì)較多；80%乙腈溶液含水較多，導致氮吹濃縮中水分不易蒸發(fā)除去，耗時且回收率低；采用1%氨化乙腈提取可抑制堿性待測化合物的離子化程度，提取效果均優(yōu)于純乙腈和1%酸化乙腈。因此本研究選擇1%氨化乙腈作為提取溶劑，既保證了氨苯砜和N-乙酰氨苯砜在提取過程的穩(wěn)定性，又提高了分析物的實際回收率，降低了蛋白質(zhì)等基質(zhì)的干擾。

圖2 不同提取溶劑對待測物的提取效果比較（n=3）Fig.2 Comparison of extraction effects with different extraction solvents（n=3）

2.4 凈化條件的優(yōu)化

為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，樣品經(jīng)提取后選用正己烷進行液液分配除脂，并對比了MCX、HLB、PRiME HLB、C184 種不同固相萃取柱的凈化效果。PRiME HLB 作為一種通過型反向固相萃取柱，提取液可直接過柱，但經(jīng)該柱萃取后樣品溶液較渾濁，且回收率不高；MCX、C18和HLB 3 種固相萃取柱使用前均需活化和平衡，MCX 固相萃取柱屬于混合型陽離子交換柱，速度快、凈化后溶液澄清，待測物回收率可達90%以上，富集凈化效果均優(yōu)于C18和HLB 柱。

實驗進一步對洗脫液種類（純乙腈、氨化乙腈）及氨化乙腈比例（4%、6%、8%、10%）和體積（4、6、10 mL）進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，氨化乙腈對目標化合物的洗脫能力更好，而4%的氨化乙腈不足以將目標化合物全部洗脫，尤其對N-乙酰氨苯砜的洗脫效果較差，回收率不到60%；6%及以上比例的氨化乙腈能將氨苯砜和N-乙酰氨苯砜洗脫下來且回收率均高于90%，但高比例氨化乙腈易引入樣品和柱填料間的其他雜質(zhì)（見圖3）。不同體積洗脫試劑的考察結(jié)果顯示，6 mL 的氨化乙腈足以將吸附在MCX 固相萃取柱上的目標化合物全部洗脫（見圖3）。綜合考慮氮吹時長和溶劑的使用量，實驗選用6 mL 6%的氨化乙腈對目標化合物進行洗脫。

圖3 不同比例與體積組合的氨化乙腈洗脫效果比較（n=3）Fig.3 Comparison of elution effects of different proportions and volume combinations of ammoniated acetonitrile（n=3）

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

由于不同種類水產(chǎn)品基質(zhì)含有的脂肪、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)的量不完全相同，因此在不同種類水產(chǎn)品樣品前處理過程和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定過程中目標化合物會有不同響應(yīng)，即基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）不同。通過基質(zhì)標準平均響應(yīng)值（A）與溶劑標準平均響應(yīng)值（B）的比值計算化合物的基質(zhì)效應(yīng)即（ME =A/B），若0.85 ＜ME ＜1.15，表示基質(zhì)效應(yīng)不明顯；ME ＜0.85，表示存在基質(zhì)抑制作用；ME ＞1.15，表示存在基質(zhì)增強作用［31］。測試結(jié)果如表2所示，氨苯砜和N-乙酰氨苯砜的基質(zhì)效應(yīng)均小于0.85，表明存在明顯的基質(zhì)抑制作用。目前常用的消除液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定過程中基質(zhì)效應(yīng)影響的方法有同位素內(nèi)標法、基質(zhì)標準溶液法等。采用氘代氨苯砜作為同位素內(nèi)標，可解決氨苯砜的基質(zhì)效應(yīng)問題，但無法完全補償其代謝產(chǎn)物N-乙酰氨苯砜的基質(zhì)效應(yīng)。為達到準確定量氨苯砜和N-乙酰氨苯砜的目的，本方法同時采用同位素內(nèi)標法和基質(zhì)匹配標準溶液法消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，使兩種化合物均獲得更高的回收率與相對標準偏差。

2.6 線性范圍、檢出限（LOD）與定量下限（LOQ）

準確移取適量混合標準中間溶液，用空白基質(zhì)溶液配制系列混合標準工作液，其中內(nèi)標物的濃度為1 ng/mL。采用本方法進行分析，分別以標準溶液中氨苯砜、N-乙酰氨苯砜峰面積與氘代氨苯砜峰面積的比值（y）為縱坐標，以氨苯砜、N-乙酰氨苯砜的含量（x，μg/kg）為橫坐標繪制標準工作曲線，對樣品進行定量分析。選取不同空白樣品基質(zhì)進行加標實驗，按照本方法提取凈化濃縮后進行檢測，得到特征離子色譜峰的信噪比（S/N）≥3 且滿足方法準確度要求時對應(yīng)的最低濃度為方法的檢出限（LOD），以S/N≥10對應(yīng)的最低濃度為方法的定量下限（LOQ）。結(jié)果顯示，氨苯砜和N-乙酰氨苯砜的基質(zhì)標準溶液均在0.1 ～5.0 μg/kg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r2 ＞0.99），LOD均為0.1 μg/kg，LOQ均為0.2 μg/kg（見表2）。

表2 不同樣品基質(zhì)中氨苯砜和N-乙酰氨苯砜的基質(zhì)效應(yīng)、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限及定量下限Table 2 Matrix effects，linear equations，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs）and limits of quantitation（LOQs）of dapsone and N-acetyl dapsone in different matrices

2.7 回收率與相對標準偏差

為研究不同水產(chǎn)品基質(zhì)對回收率的影響，在0.2、1.0、2.0 μg/kg加標水平下，分別對草魚、南美白對蝦、梭子蟹、扇貝進行氨苯砜及其代謝物的加標回收率和精密度實驗（n=6）。4 種不同類型水產(chǎn)品中待測物的平均加標回收率為94.0%～109%，相對標準偏差（RSD）為2.7%～11%。結(jié)果表明，本方法的準確度和精密度良好。

表3 不同水產(chǎn)品基質(zhì)中氨苯砜和N-乙酰氨苯砜的平均加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations（RSDs）of dapsone and N-acetyl dapsone in different aquatic product substrates（n=6）

2.8 實際樣品檢測

采用本方法對本實驗室留存的不同批次樣品中隨機抽取的魚、蝦、蟹、貝等24個樣品及農(nóng)貿(mào)市場購買的鯽魚和草魚各2個樣品進行檢測，均未檢出目標化合物。對體重為（200±25）g的健康鯽魚進行1次性口灌給藥，灌喂?jié)舛葹?00 μg/kg，分別于給藥后2、12、24 h進行采樣，采用本方法對其肌肉進行檢測。通過對化合物保留時間和離子對信息進行分析比對，鑒定出氨苯砜的代謝產(chǎn)物為N-乙酰氨苯砜。結(jié)果表明，在暴露第2、12、24 h 氨苯砜藥物的鯽魚肌肉中檢出氨苯砜含量分別為7.5、17.8、13.3 μg/kg，其代謝產(chǎn)物N-乙酰氨苯砜的含量分別為19.7、53.5、42.9 μg/kg。圖4為鯽魚陽性樣品中氨苯砜和N-乙酰氨苯砜的選擇離子流圖。

圖4 鯽魚陽性樣品中氨苯砜（A）和N-乙酰氨苯砜（B）的選擇離子流圖Fig.4 Selective ion flow diagrams of dapsone（A）and N-acetyl dapsone（B）in crucian carp positive samples a.quantitative ion；b.qualitative ion

3 結(jié) 論

本研究通過對水產(chǎn)品樣品前處理條件和儀器檢測條件進行優(yōu)化，建立了固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對水產(chǎn)品中氨苯砜及其代謝產(chǎn)物N-乙酰氨苯砜的同時定性、定量檢測。該法有效減小了基質(zhì)效應(yīng)的影響，靈敏度高、精密度好，適用于魚、蝦、蟹、貝等各類水產(chǎn)品中氨苯砜殘留的定量及確證分析，可為水產(chǎn)品中氨苯砜殘留檢測標準的修訂提供技術(shù)參考，同時為檢驗機構(gòu)日常檢測及政府質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)保障。