高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定食品接觸用橡膠奶襯制品中5種化合物的遷移量

陳銀卿，黎梓城，童 星，陳 杰，葛丹陽，彭綺珊，李 丹，胡長鷹*

（1.暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣州海關技術中心 國家食品接觸材料檢測重點實驗室（廣東），廣東 廣州 510623；3.暨南大學 包裝工程學院，廣東省普通高校產品包裝與物流重點實驗室，廣東 珠海 519070）

牧場擠奶環(huán)節(jié)是乳制品生產鏈的第一個環(huán)節(jié)，而食品接觸用橡膠奶襯是擠奶環(huán)節(jié)所需的部件，奶襯既直接接觸奶牛乳頭又直接接觸原料乳，因此奶襯的安全性值得關注。奶襯通常由丁腈橡膠或丁腈橡膠和天然橡膠混合制成，其使用壽命為2 500擠奶頭次或4 ～6個月［1-2］。因此，對于奶襯的彈性及防老化性能要求較高。為提高橡膠奶襯的性能，一般在其生產過程中會加入各種橡膠助劑，如硫化劑、填充劑、抗氧化劑、增塑劑和防老劑等［3-7］。

在擠奶過程中，奶襯與原料乳直接接觸時材料中的有害物質可能向原料乳遷移，這些物質可能是奶襯加工過程中使用的添加劑；也可能是非有意添加物（NIAS），主要包括聚合物的降解產物、單體的殘留雜質和副反應產物等［8-9］。工業(yè)生產中常用的橡膠促進劑有N-甲基苯胺（N-Methylaniline，NMA）［10-11］、二苯胍（1，3-Diphenylguanidine，DPG）［12］和2-巰基苯并噻唑（2-Mercaptobenzothiazole，MBT）［5］。研究表明，N-甲基苯胺是致癌物N-亞硝胺的前體物［13］；苯胺（Aniline，ANI）［14］和苯并噻唑（Benzothiazole，BT）［15］分別由二苯胍和2-巰基苯并噻唑等噻唑類硫化促進劑在橡膠硫化過程中分解產生并殘留在橡膠材料中。因上述5種化合物具有一定的毒性、致癌性和生殖毒性［16-19］，歐盟ResAP（2004）4 決議［20］規(guī)定MBT的特定遷移限量（SML）為8 mg/kg；ANI 和NMA 為不得檢出，檢出限（即遷移限量）為0.01 mg/kg。德國聯(lián)邦風險評估研究所（BfR）針對橡膠制品制定的風險評估建議書［21-23］規(guī)定，MBT 和DPG 的SML 分別為2、60 mg/kg。目前，分別測定上述5 種化合物的方法主要有液相色譜法［14，24-27］和液相色譜-質譜法［28-30］等，這些方法僅針對一種或一類化合物，且存在檢出限偏高和檢測時間長等不足，相關文獻報道中以檢測DPG、MBT和BT的殘留量為主，而同時測定上述5種化合物遷移量的方法未見報道。

本研究應用高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術，建立了同時測定食品接觸用橡膠奶襯中苯胺、N-甲基苯胺、二苯胍、2-巰基苯并噻唑和苯并噻唑遷移量的方法。采用該方法對市售的10種奶襯進行遷移實驗，并依據測定結果進行了合規(guī)性判定和安全性評價。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

從企業(yè)征集和市場采購10種常用的食品接觸用橡膠奶襯制品（R1 ～R10）。

標準品：苯胺（純度＞99.73%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；二苯胍（純度＞98.8%，東莞元佳實驗科技有限公司）；苯并噻唑、N-甲基苯胺、2-巰基苯并噻唑（純度＞99.0%，北京百靈威科技有限公司）。甲醇、乙醇、甲酸和乙腈（色譜純，美國Fisher Chemical 公司）；NaOH、磷酸（分析純，廣州化學試劑廠）；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200-6460型高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q超純水發(fā)生器（美國Millipore公司）；AL204 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；UF110plus型電熱恒溫鼓風干燥箱（德國Memmert公司）；針筒注射器（聚民生物科技有限公司）；尼龍濾膜（孔徑0.45 μm，天津市津騰實驗設備有限公司）；移液器（20 ～200 μL，100 ～1 000 μL，5 mL，德國Brand Transferpette公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理根據廠家提供的奶襯清洗信息，對每根奶襯在遷移實驗前進行5步清洗：用溫度為35 ～46 ℃的500 mL自來水清洗樣品；用溫度為75 ～85 ℃的500 mL NaOH 溶液（pH 2 ～14）清洗樣品；用常溫的500 mL自來水清洗樣品；用溫度為35 ～46 ℃的500 mL磷酸溶液（pH 2 ～3）清洗樣品；最后用常溫的500 mL自來水清洗樣品。奶襯需在清洗后靜置晾干1 h再進行遷移實驗。

1.3.2 標準溶液配制混合標準工作溶液：準確稱取5種標準品約0.01 g，以甲醇配制成質量濃度為1 000 mg/L 的標準儲備液；用50%乙醇逐級稀釋得到5 種化合物質量濃度分別為3、5、10、20、50、80、100、200、500 μg/L的混合標準工作溶液，于4 ℃冰箱冷藏，待測。

1.3.3 儀器工作條件色譜條件：色譜柱：Agilent Poroshell 120EC-C18（3 mm × 50 mm，2.7 μm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脫條件為：0 ～0.5 min，90% A；0.5 ～1.0 min，90% ～10% A；1.0 ～4.5 min，10% A；4.5 ～6.5 min，10%～90%A。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度290 ℃；干燥氣流速5 L/min；霧化氣壓力241 316.5 Pa（35 psi）；鞘氣溫度250 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓3 500 V。其他主要質譜條件見表1。

表1 5種化合物的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of 5 compounds

1.3.4 遷移實驗按照歐盟ResAP（2004）4 決議［20］和GB 4806.11-2016［31］，重復進行3 次遷移實驗，且每次遷移實驗均使用1份新的模擬物依次進行，并以第3次遷移實驗結果為依據進行合規(guī)性判定；對于SML 為不得檢出的化合物，以第1 次遷移實驗結果為依據進行合規(guī)性判定。根據奶襯的預期用途和可預見的最嚴厲接觸條件（預期接觸溫度不超過37 ℃，一般擠奶時間為4 ～7 min［32］），以及各國關于奶襯的相關遷移實驗條件規(guī)定，選擇50%（體積分數）乙醇溶液作為食品模擬物，遷移時間根據各國的規(guī)定分別是40 ℃10 min［21-23］、40 ℃30 min［20，31］和40 ℃120 min［33］。同時，對同一根奶襯進行重復使用60次的實驗來模擬使用3 d且每天重復使用20次的實際情況，每次的遷移條件為40 ℃10 min。

1.3.5 遷移量的計算遷移量按公式（1）計算。

式中：Mi為食品模擬物中5種化合物的特定遷移量（mg/kg）；c為遷移實驗取樣點測得的化合物質量濃度（μg/L）；c0為空白的質量濃度（μg/L）；N為稀釋倍數；V為遷移實驗浸泡液總體積（L）；S為奶襯與食品模擬物的接觸面積（dm2）；S0為奶襯實際接觸原料乳的面積（dm2）；m1為奶襯實際接觸原料乳的體積所對應的原料乳質量（kg），按密度為1 kg/L將其體積換算為相應的質量；1 000為單位換算。

1.4 安全評估

1.4.1 合規(guī)性評估方法在各國法規(guī)建立的被授權用于橡膠配方和制造的化合物肯定列表中查詢相應化合物的管控規(guī)定，若有法規(guī)管控則將遷移量與法規(guī)管控的SML進行比較，判斷是否合規(guī)。

1.4.2 安全性評估方法若化合物未出現(xiàn)在各國法規(guī)的肯定列表，使用毒理學關注閾值法（TTC）進行安全評估［34-35］。利用Toxtree 軟件（v2.6.13）對化合物進行Cramer 結構分類，Cramer Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類物質對應的安全閾值分別為1.8、0.54、0.09 mg/（person·day）。根據美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對食品接觸材料的風險評估方法對其進行安全評估。

式中：EDI（mg/（person·day））為化合物估算的每人每日攝入量；Ma（mg/kg）為奶襯中的化合物遷移到食品模擬物中的遷移量；m為每人每天的食物攝入量；CF指與特定包裝材料接觸的食品占食品總攝入量的百分數，本文的CF值為1。

1.5 數據處理

使用Excel軟件和Origin 2018軟件對數據結果進行統(tǒng)計分析和作圖，結果以“均值±標準差”的形式表示。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

根據5種化合物的結構特點，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時5 種化合物的分離效果及靈敏度。結果發(fā)現(xiàn)，流動相為乙腈-0.1%甲酸水時，5種化合物的保留時間適中且峰形較好，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動相。使用“1.3.3”的梯度洗脫條件可保證5種化合物有較好的保留時間和峰形，同時使其他不被關注的組分能及時流出色譜柱，縮短檢測時間，提高檢測效率。

2.2 質譜條件優(yōu)化

分別考察了5種化合物在大氣壓化學電離源（APCI）和ESI源的正離子與負離子掃描模式下的響應，發(fā)現(xiàn)ESI源的響應更好，故采用流動注射泵連續(xù)進樣方式優(yōu)化質譜參數。以0.1 mL/min流速注入0.5 mg/L的5 種化合物混合標準溶液，在ESI+、ESI-掃描模式下，進行一級質譜掃描確定母離子Q1；隨后，進行二級質譜掃描確定子離子，選取豐度最大的兩個離子作為子離子，其中豐度較大的作為定量離子，豐度相對較小的作為定性離子；最后，在MRM模式下對碎裂電壓、碰撞能量等參數進行優(yōu)化，優(yōu)化后5種化合物的MRM圖見圖1。

圖1 5種化合物的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of 5 compounds

2.3 線性方程、檢出限及定量下限

按照“1.3.2”配制5種化合物的系列混合標準工作溶液，在優(yōu)化條件下進行檢測，以定量離子峰面積（y）為縱坐標，對應的質量濃度（x，μg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，外標法定量。以信噪比S/N≥3計算檢出限（LOD），以S/N≥10 計算定量下限（LOQ），結果如表2 所示。5 種化合物的定量離子峰面積與其質量濃度在一定范圍內呈良好的線性關系，相關系數（r2）均不小于0.996 6，檢出限和定量下限分別為0.8～20 μg/L和3～50 μg/L，均滿足檢測要求。

表2 5種化合物的線性參數、檢出限與定量下限Table 2 Linear parameters，detection limits and quantitation limits of 5 compounds

2.4 回收率及相對標準偏差

采用標準加入法對本方法的可靠性進行驗證，以食品模擬物（50%乙醇）為空白樣品，分別添加不同濃度水平的混合標準工作溶液并按照遷移條件（40 ℃120 min）進行加標回收實驗。由表3 可知，5 種化合物在3個加標水平下的平均回收率為93.4%～112%，相對標準偏差（RSD，n=6）為0.70%～4.3%，滿足定量分析方法的相關要求。

表3 5種化合物的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（n=6）of 5 compounds standard solution

2.5 遷移實驗結果

按照“1.3.4”條件進行遷移實驗，并采用建立的方法對10 種奶襯進行測定。由圖2A可知，10個樣品中的ANI在3個遷移條件下均有檢出，且均高于遷移限量（0.01 mg/kg），最大遷移值在40 ℃120 min遷移條件下，達0.34 mg/kg；由圖2B可知，8個樣品中的NMA在3個遷移條件下均超標，在40 ℃120 min遷移條件下達0.03 ～2.18 mg/kg，而僅有R4 和R10 未檢出。根據相關法規(guī)要求，ANI 和NMA 的檢出對人體存在健康風險，應引起高度關注，有必要改進配方或工藝來控制ANI和NMA的生成。

圖2 橡膠奶襯（R1 ～R10）中苯胺和N-甲基苯胺向50%乙醇中的遷移量Fig.2 Migration amounts of ANI and NMA from rubber liners（R1-R10）to 50%ethanol

對于有SML規(guī)定的DPG 和MBT 則根據第3次遷移實驗結果來評判（圖3）。由圖3A 可知，DPG 僅在R1中檢出，且在3個遷移條件下均未超標。可能是奶襯生產企業(yè)在配方設計時對該類物質的使用量較低。由圖3B 可知，MBT 在40 ℃10 min遷移條件下均未超過2 mg/kg 的限值；MBT 向50%乙醇的遷移量隨著遷移時間的延長而增加，在40 ℃30 min 和40 ℃120 min 遷移條件下10 個樣品的遷移量均未超過8 mg/kg的限值。由此可見，MBT在合成橡膠材料及其制品中普遍使用，雖有檢出，但遠小于法規(guī)的限量要求。

圖3 橡膠奶襯（R1 ～R10）中二苯胍和2-巰基苯并噻唑向50%乙醇中的遷移量Fig.3 Migration amounts of DPG and MBT from rubber liners（R1-R10）to 50%ethanol

BT 向50%乙醇的遷移量隨著遷移時間的延長而增加（圖4）。奶襯預期接觸的食品是原料奶，根據中國居民膳食指南（2016）［36］，推薦人均每日奶類食物的攝入量為0.30 kg。由式（2），上述10 種奶襯中BT 遷移到50%乙醇的最大遷移量的安全評估結果如表4。結果表明，有8 種奶襯制品遷出BT，相應的EDI均超過安全閾值（0.09 mg/（person·day）），對人體健康產生危害的可能性較高，需引起關注。

圖4 不同遷移時間下橡膠奶襯（R1 ～R10）中苯并噻唑向50%乙醇中的遷移量Fig.4 Migration amounts of BT from rubber liners（R1-R10）to 50%ethanol at different migration test

表4 苯并噻唑的安全評估結果Table 4 The safe assessment results of BT

對同一根奶襯通過多次重復使用實驗研究奶襯中5 種化合物向50%乙醇的遷移規(guī)律。結果表明，隨著使用次數的增加，奶襯中5 種化合物的遷移量變化不穩(wěn)定，總體呈減少趨勢。對于SML 為不得檢出的ANI和NMA，使用60次均有檢出；DPG和MBT使用60次均有檢出，但在限量范圍內，安全可控。

3 結 論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定食品接觸用橡膠奶襯中5 種化合物的方法。該方法具有操作簡單、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，檢出限低于法規(guī)和標準中的特定遷移限量要求，具有較強的適用性，可為奶襯等相關產品質量監(jiān)控提供科學依據和技術支持。利用該方法對市售10種奶襯進行了模擬遷移實驗，發(fā)現(xiàn)奶襯中5 種化合物均有遷出，二苯胍和2-巰基苯并噻唑的遷移量在限量范圍內且安全可控；苯并噻唑的檢出需引起關注；苯胺、N-甲基苯胺的遷移量高于遷移限量，有必要改進配方或工藝來控制其生成。