納米纖維固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中25種糖皮質(zhì)激素

吳肖肖，蔣迪堯，梅秀明，康學(xué)軍，李雨楓，張 馳*

（1.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院 國家市場監(jiān)管重點實驗室（生物毒素分析與評價），江蘇 南京 210019；2.東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096）

糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GCs）為類固醇激素，是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，具有抗炎、抗過敏、抗毒、抗休克等藥理作用，同時能提高飼料的轉(zhuǎn)化率、促進畜禽生長，因而在畜牧業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用［1-3］。然而，過量的不合理使用會導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素類藥物在動物體內(nèi)殘留，進而危害人體健康，引起肥胖、高血壓等疾?。?-5］。因此，各國對動物源性食品中糖皮質(zhì)激素的最大殘留量進行了規(guī)定。如GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》［6］和歐盟法規(guī)（EU）No.37/2010［7］均規(guī)定牛奶中倍他米松和地塞米松的最大殘留量為0.3 μg/kg，氫化可的松僅作外用，未指定殘留限量。

目前，同時測定多種糖皮質(zhì)激素的方法主要有液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法以及毛細管電泳法等［8-17］。高效液相色譜-質(zhì)譜法因具有高靈敏度和高選擇性，是痕量分析的常用方法，但其樣品需凈化以減少基質(zhì)干擾，而傳統(tǒng)的固相萃取前處理方法比較耗時費力［18］。

靜電紡絲是一種在強電場作用下將聚合物溶液噴射拉伸得到直徑為納米級纖維的紡絲技術(shù)。靜電紡絲納米纖維具有直徑小、比表面積大、孔隙率高、易于修飾等特點，基于納米纖維的固相萃取技術(shù)具有操作簡單、快速、有機溶劑用量少的優(yōu)點［19-21］。本研究制備了聚苯乙烯（PS）納米纖維，并對其形貌、特征基團、接觸角、比表面積等參數(shù)進行表征，利用強疏水性PS納米纖維對有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的糖皮質(zhì)激素的良好吸附性，通過納米纖維固相萃取技術(shù)對樣品提取液中的糖皮質(zhì)激素進行富集與凈化，基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），建立了牛奶中潑尼松龍等25 種糖皮質(zhì)激素的檢測方法，并將該方法應(yīng)用于市售牛奶樣品檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6470 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（美國安捷倫科技有限公司）；ML304T 分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Centrifuge 5430R 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；N-EVAP 112 氮吹儀（美國Organomation 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；DWP403-1AC 高壓電源（天津東文高壓電源廠）；SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本株式會社日立制作所）；JEOL JEM-00F高分辨透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Alpha 傅里葉紅外光譜儀（德國布魯克光譜儀器公司）；CHD-JCJ180A-1接觸角測量儀（東莞誠鼎儀器科技有限公司）；ASAP 2460 全自動比表面與孔隙度分析儀（美國麥克默瑞提克儀器公司）。

1.2 試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品：潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、曲安奈德、氟氫縮松、地塞米松醋酸酯和氫化可的松丁酸酯（100 mg/L，溶于甲醇）；可的松（1 000 mg/L，溶于甲醇），氟米松（純度≥99.8%），氟氫可的松醋酸酯、可的松醋酸酯、甲基潑尼松龍醋酸酯、倍他米松醋酸酯（純度≥99.5%），購自上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；潑尼松龍醋酸酯（100 mg/L，溶于甲醇）、曲安西龍雙醋酸酯（1 000 mg/L，溶于甲醇）、氫化可的松醋酸酯（純度＞99%），氟米龍醋酸酯（100 mg/L，溶于乙腈），購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；地夫可特（純度≥99%）、布地奈德（純度≥98%），購自多倫多化學(xué)研究所；潑尼松醋酸酯（純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；氟米龍（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

乙腈、甲醇（LC-MS 級，純度≥99.9%），購自上海安譜實驗科技股份有限公司；甲酸、乙酸（HPLC級，純度≥99.9%），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚苯乙烯（18 500 Da），購自上?；瘜W(xué)試劑研究院；四氫呋喃（THF）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（分析純，純度≥99.59%），購自國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司。

不同品牌的牛奶實際樣品隨機購自南京市中、大型超市。

1.3 納米纖維制備、表征及固相萃取柱的制備

1.3.1 納米纖維制備將1 g PS溶于10 mL THF和DMF的混合溶劑（6∶4，體積比）中，在室溫下攪拌16 h。將混合紡絲溶液裝入玻璃注射器中（配不銹鋼針頭），用導(dǎo)線連接不銹鋼針與高壓電源正極，收集屏連接電源負極，距離不銹鋼針20 cm處放置。在24 kV電壓下，以2.0 mL/h速度推進溶液，噴出的纖維落于鋁箔收集屏上，得到PS納米纖維。

1.3.2 納米纖維表征分別用場發(fā)射掃描電子顯微鏡、高分辨透射電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀、接觸角測量儀和全自動比表面與孔隙度分析儀對PS 納米纖維的形貌、特征峰、吸附性能等指標(biāo)進行表征。

1.3.3 凈化柱的制備與活化稱取8 mg 納米纖維，用實心金屬圓柱體送至固相萃取柱下端，壓緊制成固相萃取小柱。依次取200 μL甲醇和400 μL水流過柱內(nèi)纖維，完成固相萃取柱的活化。

1.4 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解或稀釋配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于4 ℃冰箱中備用。

乙酸水-甲醇溶液：50%（體積分數(shù)）乙酸水溶液和甲醇以體積比2∶98混合而成。

1.5 樣品處理

精確稱取0.5 g 牛奶于10 mL 離心管中，加入5 mL 乙腈，渦旋5 min，以7 500 r/min 離心15 min，取上清液，氮氣吹干。用1 mL 5%（體積分數(shù)）乙腈水溶液溶解，過0.22 μm 有機濾膜，過活化后的PS納米纖維固相萃取柱，用100 μL 甲醇洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，待質(zhì)譜檢測。樣品處理流程見圖1。

圖1 樣品處理流程圖Fig.1 Flow chart of sample processing

1.6 色譜-質(zhì)譜條件

1.6.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C1（82.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0 ～4.5 min，20%B；4.5 ～7 min，20%～45%B；7 ～9 min，45% ～52% B；9 ～10 min，52% ～55% B；10 ～12 min，55% ～65% B；12 ～14 min，65% ～90%B；14 ～15 min，90%B；后運行：2 min；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.6.2 質(zhì)譜條件離子源：雙噴射流電噴霧離子源（Dual AJF ESI），掃描模式：正離子模式，檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化器壓力：310 kPa；氣體溫度：350 ℃，氣體流速：12 L/min；鞘氣（N2）溫度：250 ℃，鞘氣（N2）流速：11 L/min；毛細管電壓：3 500 V。25 種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 25種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of 25 glucocorticoids

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維表征

2.1.1 纖維形貌與紅外表征在掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）下，PS 納米纖維的SEM 圖、TEM 圖以及直徑分布圖見圖2A-C。由圖可知，PS納米纖維表面光滑，無明顯串珠，纖維的平均直徑為（818.3±297.5）nm。

PS 納米纖維的紅外光譜圖見圖2D。根據(jù)特征峰［22］判斷，纖維的主成分是PS，其中特征峰696、756 cm-1來自單取代苯環(huán)===== CH 面外變形，1 028 cm-1來自單取代苯環(huán)===== CH 面內(nèi)變形，1 452、1 493、1 601 cm-1來自苯環(huán)—C===== C—彎曲振動，2 849 cm-1來自—CH2—對稱伸縮振動，2 922 cm-1來自—CH2—不對稱伸縮振動，3 001、3 025、3 064、3 084 cm-1來自===== CH—伸縮振動。

圖2 PS納米纖維的SEM圖（A）、TEM圖（B）、直徑分布圖（C）和紅外光譜圖（D）Fig.2 SEM（A），TEM（B），diameter distribution images（C）and infrared spectrum（D）of PS nanofibers

2.1.2 纖維接觸角與比表面積采用接觸角測量儀測得PS 納米纖維的接觸角為136.12°，表明PS 納米纖維具有良好的疏水性，對具有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的疏水性糖皮質(zhì)激素有較好的吸附性。經(jīng)測試，PS納米纖維的比表面積為57.41 m2/g，孔體積為0.33 cm3/g，平均孔徑為24.33 nm。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）規(guī)定的孔尺寸定義，PS納米纖維表面的孔為介孔（2 ～50 nm）。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

為提高分析效率，在盡可能縮短保留時間的同時，需將25種糖皮質(zhì)激素最大程度地分離，尤其是具有相同定性和定量離子對的倍他米松與地塞米松，以及倍他米松醋酸酯與地塞米松醋酸酯2 對同分異構(gòu)體，必須以保留時間的差別加以區(qū)分。經(jīng)過優(yōu)化梯度洗脫程序、碰撞能等色譜-質(zhì)譜條件，25種糖皮質(zhì)激素以及2 對同分異構(gòu)糖皮質(zhì)激素均能通過色譜峰的保留時間或離子對質(zhì)荷比的差異實現(xiàn)定性和定量，提取離子流色譜圖見圖3。

圖3 25種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）與2組同分異構(gòu)糖皮質(zhì)激素（B）的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms（EIC）of 25 glucocorticoids mixed standard solution（A）and two pairs of isomeric glucocorticoids（B）the numbers marked in the EIC represent the same analytes as those in Table 1

2.3 萃取條件優(yōu)化

納米纖維固相萃取技術(shù)的原理是通過纖維和目標(biāo)物之間的相互作用力實現(xiàn)吸附，再將吸附在纖維上的目標(biāo)物解離。因此，纖維對目標(biāo)物的作用力既要能實現(xiàn)吸附，又不能有太強的吸附，否則難以洗脫。由纖維表征結(jié)果可知，PS納米纖維的疏水性強，通過π-π鍵共軛作用可實現(xiàn)對有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的糖皮質(zhì)激素的吸附。將5%乙腈水溶液稀釋配制的25種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg/L）過活化后的PS納米纖維柱，按照公式（1-殘留在柱后溶液中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)/標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜響應(yīng)）×100%計算吸附效率，結(jié)果顯示25種糖皮質(zhì)激素的吸附效率均大于95%。分別采用甲醇、乙酸水-甲醇溶液對吸附在纖維上的目標(biāo)物進行洗脫，通過洗脫液與相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜響應(yīng)比值計算得到目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果見圖4。由圖可知，雖然潑尼松、潑尼松龍等6個糖皮質(zhì)激素的提取效率在酸性條件下略高于甲醇，但可的松醋酸酯、氟氫可的松醋酸酯等目標(biāo)物在酸性條件下的提取效率極低，無法滿足檢測要求。而甲醇洗脫時，25種目標(biāo)物的提取效率為83.6%～109%，可滿足檢測要求。因此，選擇甲醇作為洗脫溶劑。

圖4 不同洗脫溶劑對25種糖皮質(zhì)激素提取效率的影響（n=3）Fig.4 Effect of different elution solvents on extraction efficiency of 25 glucocorticoids（n=3）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

為考察牛奶樣品中25 種糖皮質(zhì)激素的基質(zhì)效應(yīng)（ME），將空白牛奶樣品按照“1.5”方法進行處理，得到空白樣品基質(zhì)。采用空白樣品基質(zhì)和甲醇分別配制1 ～100 μg/L 系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.6”條件進行檢測，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率百分比（SR）評價基質(zhì)效應(yīng)。SR越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)越??；SR ＜100%，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；SR ＞100%，表明存在基質(zhì)增強效應(yīng)。結(jié)果顯示，25 種糖皮質(zhì)激素的SR 在94.4%～104%范圍內(nèi)，表明采用聚苯乙烯納米纖維固相萃取柱對牛奶樣品提取液進行萃取處理，達到了較好的基質(zhì)凈化作用。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限準(zhǔn)確移取適量的25種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%乙腈水溶液配成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法處理后進行檢測。采用外標(biāo)法定量，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/L），相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，25 種糖皮質(zhì)激素在1 ～100 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.995。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度逐級遞減，按本方法處理后進行檢測，計算檢出限（LOD，S/N≥3）和定量下限（LOQ，S/N≥10）。結(jié)果顯示，25 種糖皮質(zhì)激素的LOD為0.04 ～0.10 μg/kg，LOQ為0.13 ～0.33 μg/kg（見表2）。

表2 25種糖皮質(zhì)激素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of 25 glucocorticoids

（續(xù)表2）

2.5.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為進一步驗證方法的準(zhǔn)確性，在空白牛奶樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使待測物含量分別為0.5、5.0、20.0 μg/kg，每個加標(biāo)水平平行制備6份樣品，采用本方法處理后上機測定。根據(jù)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果表明，25 種糖皮質(zhì)激素的回收率為71.5%～105%，RSD為1.8%～10%（見表3）。

表3 25 種糖皮質(zhì)激素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 25 glucocorticoids（n=6）

2.6 實際樣品測定

應(yīng)用本方法檢測市售10 批次牛奶樣品中25 種糖皮質(zhì)激素的含量，僅在1 批次樣品中發(fā)現(xiàn)微量的氫化可的松（圖5），含量為0.35 μg/kg，國標(biāo)中未指定其殘留限量。其余樣品均未檢出25 種糖皮質(zhì)激素殘留。

圖5 陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.5 EIC of the positive milk sample

3 結(jié) 論

本研究采用納米纖維固相萃取法進行前處理，以聚苯乙烯納米纖維固相萃取柱進行富集、凈化，基于UPLC-MS/MS 技術(shù)建立了牛奶中25 種糖皮質(zhì)激素的檢測方法。該方法具有前處理操作簡單，有機溶劑用量少，基質(zhì)效應(yīng)不顯著，準(zhǔn)確性好，靈敏度高等優(yōu)點，適用于牛奶中糖皮質(zhì)激素殘留的檢測。