食品微生物檢測中 PCR技術(shù)的實(shí)踐研究

代真真 邢蘇 宋曉婉 歐金玉

隨著社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展以及收入水平的不斷提高，人們對于食品的消費(fèi)能力日漸提高，為了滿足人們多樣化的消費(fèi)需求，各種食品類型逐漸在市場中涌現(xiàn)出來。在這樣的背景下，對食品質(zhì)量安全進(jìn)行嚴(yán)格謹(jǐn)慎的監(jiān)測就顯得尤為重要。在信息化時代，越來越多先進(jìn)的食品安全檢測技術(shù)被大力研發(fā)和應(yīng)用，本文主要分析了PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用，以供實(shí)踐參考。

PCR技術(shù)是一種有效調(diào)查食品源疾病暴發(fā)以及對食品源相應(yīng)病原菌進(jìn)行鑒定的工具，在食品微生物檢測中有著非常廣泛的應(yīng)用，具有較高的靈敏度、極強(qiáng)的特異性、精準(zhǔn)快速等優(yōu)勢。因此，科學(xué)合理地推廣應(yīng)用PCR技術(shù)，對于做好食品檢測工作、預(yù)防食源性疾病以及評估食源性疾病的危險性等都有著十分重要的意義。

一、PCR技術(shù)的原理及類型

1.原理。在食品微生物檢測過程中，PCR技術(shù)的主要原理是反復(fù)操作三個不同步驟的不同環(huán)節(jié)，包括高溫變性、中溫延伸、低溫退火等，以便對微生物核酸序列進(jìn)行有效的檢測，而在實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的目標(biāo)時則是在單個核酸分子序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)制來完成。具體來說，高溫變性是在94℃的高溫下，如果處于雙鏈狀態(tài)的食品微生物的DNA序列會發(fā)生變性現(xiàn)象，也可以順利解鏈，那么其存在形式就是雙鏈。中溫延伸是在72℃的情況下，將被測食品微生物的引物所發(fā)揮的引導(dǎo)延伸作用作為相應(yīng)的條件進(jìn)行復(fù)制，從而將微生物的DNA序列有效地檢測出來。低溫退火是在55℃以下，食品微生物在被檢測過程中有效融合了特異性引物以及單鏈狀態(tài)下的DNA。反復(fù)對以上三個步驟進(jìn)行操作，直到能夠?qū)⑽⑸锏腄NA序列檢測出來并且數(shù)量充足，這樣才能符合PCR技術(shù)的實(shí)際檢測要求。

2.類型。（1）常規(guī)PCR檢測。運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的食品微生物檢測時，需要利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化作用，獲得緩沖液與MgCl2溶液發(fā)生反應(yīng)后的混合物，擴(kuò)增被界定的DNA片段。（2）多重PCR檢測。與傳統(tǒng)的PCR檢測原理相比，多重PCR的檢測原理并沒有什么不同，不過與各引物的模板存在著特異性互補(bǔ)，即將1對以上的特異性引物加入到同一反應(yīng)體系中，這樣就能實(shí)現(xiàn)同時將一條以上的目的DNA片段在同一個反應(yīng)管中擴(kuò)增。利用這樣的方法，能夠?qū)?個以上的基因同時進(jìn)行檢測或者是確定其交叉限制。（3）熒光定量PCR檢測。在傳統(tǒng)的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀中應(yīng)用熒光能量傳遞技術(shù)，并促使受體發(fā)色團(tuán)偶極之間產(chǎn)生相互作用，這就是熒光定量。在利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測時，通過熒光訊號就能夠獲取靶序列的初始濃度，能量也會被快速轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，此時熒光訊號強(qiáng)度就能與DNA數(shù)量產(chǎn)生正比例關(guān)系，進(jìn)而達(dá)到定量的目的。

二、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測中的主要作用

PCR技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的簡稱，這是一種基因技術(shù)，在利用這項技術(shù)進(jìn)行食品微生物檢測時，為了有效地獲得目標(biāo)DNA片段，需要采用體外模擬DNA的復(fù)制過程來實(shí)現(xiàn)，這樣有利于分析和判定實(shí)驗對象的基因特征。在應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)際的食品微生物檢測時，可以有效地將食品檢測樣品中的各種微生物都進(jìn)行有效的基因標(biāo)記，并且能夠?qū)⑦@些基因都復(fù)制下來，從而在食品樣品較多的情況下也能利用較短的時間進(jìn)行有效檢測，這樣不但可以實(shí)現(xiàn)極高的自動化檢測，而且操作非常簡單便捷，極大地提高了食品微生物檢測的效率和質(zhì)量。

三、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測中的主要流程

1.引物設(shè)計。PCR擴(kuò)增的特異性能否成功與引物的優(yōu)劣有著直接的關(guān)系。近些年來，分子生物學(xué)的發(fā)展非常迅速，對于各種微生物基因的研究越來越深入，使得其基因序列也變得越來越明了，從而更容易進(jìn)行引物設(shè)計。為了能夠確保引物設(shè)計的準(zhǔn)確性，還需要全面了解檢測對象的遺傳背景。

2.模板的制備。為了確保PCR檢測技術(shù)的準(zhǔn)確性與可靠性，必須有效提高目標(biāo)模板的純度，確保目標(biāo)分子的數(shù)量充足，因此富集步驟是多數(shù)PCR檢測中都不可缺少的。

四、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測中的應(yīng)用特點(diǎn)

1.操作簡單。實(shí)際的食品微生物檢測工作會涉及到很多方面，比如微生物生長所必備的培養(yǎng)基、微生物生長環(huán)境中的溫度和酸堿度等，要根據(jù)微生物的類型以及實(shí)際的檢測需求設(shè)計不同的檢測方式，投入一定的檢測時間、檢驗人員以及檢測中需要的物力資源，嚴(yán)格密切地觀察培養(yǎng)基中的菌落、微生物細(xì)胞等特征并鑒定其生理生化等。因此，在以往的食品微生物檢測中所使用的傳統(tǒng)自動化技術(shù)不僅達(dá)不到檢測的高度，花費(fèi)的時間還比較長，使得檢測工作的效率非常低。而PCR技術(shù)這種高自動化檢測技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用剛好能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)自動化檢測技術(shù)的不足，不但操作非常簡單便捷，而且只需要一個檢測人員就能對所有檢測程序進(jìn)行有效控制，極大提高了檢測效率。

2.檢測快捷。應(yīng)用傳統(tǒng)的自動化檢測技術(shù)進(jìn)行食品微生物檢測時，往往需要花費(fèi)2-5天的時間等待檢測結(jié)果，有些微生物的檢測甚至需要花費(fèi)一周或者更長的時間，這就可能導(dǎo)致一些食品在檢測過程中就已經(jīng)投入到市場。而有些食品則是在檢測中發(fā)生霉變，導(dǎo)致還未流入市場就已經(jīng)受到損壞，從而給生產(chǎn)企業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了高效地解決傳統(tǒng)檢測技術(shù)存在的這些不足，就可以使用PCR技術(shù)對食品微生物進(jìn)行檢測。PCR技術(shù)是一種高自動化的檢測技術(shù)，完全可以有效規(guī)避檢測時間比較長的問題，通常在很短的時間內(nèi)就能得到精準(zhǔn)的檢測結(jié)果，多數(shù)是幾個小時，有些微生物在檢測時花費(fèi)的時間較長，但也不會超過1天。

3.準(zhǔn)確率高。隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，食品微生物種類越來越多，傳統(tǒng)的自動化檢測技術(shù)并不能高效地將微生物從食品中分離出來，更難以全面辨別食品微生物的種類。比如，傳統(tǒng)的自動化檢測技術(shù)很難將菌落檢測出來，即便檢測出來了，也難以進(jìn)行有效的培養(yǎng)，使得食品微生物檢測工作進(jìn)行得并不順利，效率也無法提高。應(yīng)用PCR技術(shù)，不僅能夠精準(zhǔn)地提取食品中的微生物，還能科學(xué)合理地進(jìn)行培養(yǎng)，既有利于微生物類型的判斷，又能夠使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確，從而為食品生產(chǎn)監(jiān)督提供極大的便利和主要的參考依據(jù)，進(jìn)一步保障食品安全。

4.發(fā)展空間比較大。作為一種高自動化技術(shù)，PCR技術(shù)在食品微生物檢測中有著巨大的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)的食品微生物檢測技術(shù)相比，PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍更廣，檢測所花費(fèi)的時間、人力、物力等相對較少，而且檢測質(zhì)量也比較高，潛在的發(fā)展空間巨大。隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展以及高新技術(shù)的推廣與應(yīng)用，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，而且這項技術(shù)本身就具有較高的靈敏性與極強(qiáng)的特異性，在我國食品行業(yè)的生產(chǎn)管理中或者是食品流通過程中，PCR技術(shù)都能發(fā)揮出極大的作用。

五、PCR技術(shù)在食品

微生物檢測中的注意事項

1.PCR模板的制備。各類食品中會存在非常多的PCR抑制因子，為了確保食品微生物檢測的準(zhǔn)確性，就要盡量除去這些抑制因子，這對于最終的檢測結(jié)果有著直接的影響。因此，在微生物的核酸提取時或是對食品樣品進(jìn)行處理時，都離不開模板的制備，特別是對食品樣品進(jìn)行處理時，更需要注重PCR模板的制備。

2.檢測對象的生物活性。在對食品微生物進(jìn)行檢測時，從理論上而言，只要是能夠提供核酸的樣品都可以實(shí)現(xiàn)PCR的擴(kuò)增，這主要是由于在檢測DNA時使用的細(xì)胞并不一定是活細(xì)胞，這也表明PCR技術(shù)并不能有效區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。

六、PCR技術(shù)的發(fā)展方向

在信息化的時代發(fā)展背景下，食品微生物檢測中所應(yīng)用的PCR技術(shù)愈發(fā)先進(jìn)，所發(fā)揮的作用也越來越大。未來，PCR技術(shù)的發(fā)展方向主要集中于以下三個方面：

1.DNA或者RNA模板的純度要求逐漸提高。在食品微生物檢測工作中，DNA或者RNA模板的純度對于PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有著直接的影響，所以要想提高PCR檢測技術(shù)的準(zhǔn)確性，就需要提高模板的純度。

2.進(jìn)一步攻克PCR檢測實(shí)驗中的假陽性問題。食品中存在著種類眾多的微生物，而且這些微生物不具備穩(wěn)定性，所以在檢測過程中會受到PCR技術(shù)的高靈敏度影響而導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)。為了有效解決這一問題，未來應(yīng)把提高PCR檢測技術(shù)的準(zhǔn)確性作為工作重點(diǎn)。

3.PCR技術(shù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字化PCR技術(shù)。在大數(shù)據(jù)時代，PCR技術(shù)在發(fā)展過程中也需要緊密結(jié)合數(shù)據(jù)技術(shù)，將芯片設(shè)計與制作作為重點(diǎn)，利用內(nèi)置芯片將PCR技術(shù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字化PCR技術(shù)。內(nèi)置芯片的應(yīng)用能夠進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)微滴式可智能識別的檢測技術(shù)目標(biāo)，極大地提高食品微生物檢測工作的效率和質(zhì)量，進(jìn)一步改善傳統(tǒng)PCR技術(shù)中的一些不足之處，全面突破傳統(tǒng)檢測技術(shù)中檢測結(jié)果所受到的限制，比如不再受標(biāo)準(zhǔn)溶液以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的局限，使得檢測結(jié)果更加精準(zhǔn)。在未來的發(fā)展中，數(shù)字化的PCR技術(shù)在食品微生物檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用會有更加廣闊的發(fā)展前景。