不同根腫病抗性油菜根系分泌物的代謝組研究

陳宇紅， 蔣學(xué)飛， 蘇 瀅， 王茂林

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 成都 610064)

1 引 言

十字花科根腫病是由蕓薹屬根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)引起的土傳性病害，包括擬南芥，白菜，油菜等在內(nèi)的眾多十字花科植物或經(jīng)濟作物均會罹患此病，每年都會造成巨大損失，而且隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，根腫病的發(fā)病面積和危害程度也在逐年增加[1]，因此對根腫菌的研究和對根腫病的防治已經(jīng)到了刻不容緩的地步.

囿于根腫菌的寄生特性，現(xiàn)階段對于根腫菌的認識水平仍較低，目前研究者普遍認同將根腫菌的生活史可分為三個階段：根毛侵染，皮層侵染以及休眠孢子時期[2]. 首先，土壤中的休眠孢子在有合適寄主存在的情況下會被某些特定的刺激物誘導(dǎo)萌發(fā)，形成具兩根不等長鞭毛的初級游動孢子[2]. 而后這些初級游動孢子泳動或吸附到寄主的根毛上，形成根毛感染. 在根毛中，初級孢子囊發(fā)育成熟為次級游動孢子并再次釋放到環(huán)境中，等待進入皮層侵染階段[3]. 皮層中柱的次級孢子囊不斷分裂，擴增，最終形成休眠孢子充滿寄主的根部細胞，待宿主腐爛重新釋放到土壤中，直到下一輪侵染開始[4]. 初級游動孢子一旦侵入宿主，就可以隔絕外部的不利環(huán)境[5]，在土壤中的休眠階段，孢子又具有一層厚厚的幾丁質(zhì)，可保證其在各種惡劣的土壤環(huán)境中存活很長時間[6]，因此，根腫菌的孢子在萌發(fā)之后但未成功入侵寄主的這個短暫時期對于根腫病的發(fā)病和預(yù)防而言都很關(guān)鍵. 已有證據(jù)表明根腫菌在這個階段是最脆弱的[5]，利用此特征的根腫病防治辦法也有報道，例如，選擇非寄主作物進行輪作，再次種植寄主植物發(fā)病率可顯著降低，或種植易感的寄主作物，在發(fā)病期用藥或處理土壤都可顯著降低后續(xù)作物的發(fā)病率[7,8]. 因此，探究影響休眠孢子萌發(fā)的因素具有重要意義.

休眠孢子的萌發(fā)受許多因素的影響. 首先，休眠孢子在有宿主存在的情況下會大量萌發(fā)，但在沒有宿主的情況下也會少量萌發(fā)，這種萌發(fā)可能是受到合適的土壤濕度和溫度刺激. 休眠孢子的萌發(fā)也受到pH值影響，在pH值為5.0至7.0時，休眠孢子的萌發(fā)率較高，在pH值大于7.0時萌發(fā)率較低[9]，而在更高pH值下萌發(fā)率被抑制得更加明顯[10].休眠孢子萌發(fā)的最佳溫度為24 ℃，最高致死溫度為45 ℃，可見光會抑制萌發(fā)[5]. 另一方面，植物尤其是寄主植物對休眠孢子萌發(fā)的研究也由來已久，Macfarlane(1970)很早便發(fā)現(xiàn)根系分泌物能夠刺激休眠孢子的萌發(fā)，且這種刺激作用與根系分泌物的來源密切相關(guān)[10]. 首先，十字花科宿主作物的根系分泌物比非宿主植物更有效，一些非十字花科植物宿主，如多年生黑麥草(LoliumperenneL.)、紅三葉草(TrifoliumpratenseL.)、果嶺草(DactylisglomerataL.)和翦股穎(AgrostisstoloniferaL.)，根系分泌物比非宿主植物的作用強，有時甚至比十字花科宿主更有效[9,11]. 對于同一物種，易感材料的根系分泌物比抗性的更有效，例如，用來自易感甘藍(B.oleraceavar.capitata)的根系分泌物處理后，休眠孢子的萌發(fā)率最高(75%)[12]. 這些研究表明根系分泌物中或有一些與根腫菌休眠孢子萌發(fā)密切相關(guān)的代謝物，它們的存在和含量高低直接決定了刺激休眠孢子的萌發(fā)的效率，但目前關(guān)于這種刺激物的研究卻鮮有報道，而通過對比寄主非寄主，抗病和易感植株的根系分泌物組分可以幫助我們尋找這種關(guān)鍵的代謝物.

非靶向代謝組技術(shù)，是一種不局限于預(yù)先確定的已知代謝物，可以發(fā)現(xiàn)更多與植物代謝有關(guān)新物質(zhì)的方法. 以前檢測植物代謝物的常用方法是氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[13,14]，雖然這是分析小型極性代謝物的最佳方法，但由于需要對每個分子進行化學(xué)修飾以增加揮發(fā)性，因此無法檢測大多數(shù)較大的植物次生代謝物，如復(fù)雜的生物堿和甘油磷酸脂等. 與GC-MS相比，超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)是一種非常適合大規(guī)模調(diào)查生物系統(tǒng)代謝物的分析方法[15]. Kc84-1是在之前的工作中篩選出的具有較好的根腫病抗性的甘藍型油菜材料，華雙5R是已獲廣泛推廣種植的抗根腫病材料，R-197是易感材料. 在本研究中，我們利用UPLC-QTOF-MSE技術(shù)，結(jié)合多變量數(shù)據(jù)分析模型，對三個不同根腫病抗性水平的甘藍型油菜根系分泌物中的次級代謝物進行檢測鑒定和比較分析，篩選出一些差異代謝物. 并進一步驗證差異代謝物與孢子萌發(fā)之間的關(guān)系，以及萌發(fā)率和根腫病發(fā)病率之間的關(guān)系，為油菜根腫病發(fā)病機理的研究及病害防治提供了一定的資料.

2 材料與方法

2.1 材 料

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)材料：根腫病易感材料R-197；根腫病抗性材料華雙5R(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張椿雨老師贈予)和Kc84-1(本實驗室保有).

2.2 方 法

2.2.1 休眠孢子的制備 取保存于-20 ℃的根腫攪碎，紗布過濾后離心，先3100 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用蒸餾水懸浮后再3100 r/min離心15 min，重復(fù)3次. 棄上清，用50%蔗糖溶液懸浮沉淀物，3100 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的50 mL無菌離心管中，補無菌水至30 mL，離心，棄上清，洗滌2遍，用2%的新鮮氯胺-T處理20 min，而后用抗生素(1000 μg/mL硫酸粘桿菌素，1000 μg/mL鹽酸萬古霉素，6000 μg/mL頭孢噻肟鈉)處理過夜，無菌水洗3遍，檢查除菌情況. 4 ℃保存?zhèn)溆?

2.2.2 根系分泌物的制備 甘藍型油菜種子經(jīng)1%的NaClO表面消毒8 min，無菌水洗3次，播于1/2 MS固體培養(yǎng)基中萌發(fā)5 d. 將石英砂淘洗干凈，并180 ℃干熱滅菌3 h，冷卻后分裝至培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿50 g石英砂，而后將裝有石英砂的培養(yǎng)皿再置于蒸汽滅菌鍋中121 ℃，30 min，冷卻后每個培養(yǎng)皿加入30 mL無菌水(pH 6.3). 將萌發(fā)的油菜幼苗分裝于裝有石英砂的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿20株(3種材料，每種6個重復(fù)). 將此裝置置于光照培養(yǎng)箱中(16 h/8 h；24 ℃/20 ℃；光照/黑暗；相對濕度50%). 10 d后，將植物移出，收集根系分泌物，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾. 部分立即用于休眠孢子的萌發(fā)實驗，取部分(20 mL)用液氮速凍，儲存于-80 ℃，用于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-MS)分析.

2.2.3 休眠孢子的萌發(fā)及鑒定 將無菌的休眠孢子用新制備的根系分泌物或無菌水(pH 6.3)調(diào)整濃度為每毫升1×107個孢子，200 r/min 25 ℃搖床黑暗孵育. 每24 h對各處理的休眠孢子進行萌發(fā)率調(diào)查. 用醋酸地衣紅染色，在Nikon DS-Ri2顯微鏡下對每個樣品300個孢子進行計數(shù)分類. 每次測量重復(fù)3次. 使用OriginLab對數(shù)據(jù)進行方差分析，使用Duncan多重檢驗(P≤ 0.05)評估每個時間點處理之間的差異.

之前的研究已經(jīng)建立了一個檢驗根腫菌休眠孢子萌發(fā)率的方法，即在顯微鏡視野中孢子萌發(fā)的第一個特征是休眠孢子所特有的折射球消失，孢子的萌發(fā)可以通過這種方式區(qū)分[10, 16]. 而用醋酸地衣紅染色后這種差異更易區(qū)分，即萌發(fā)的孢子是不被著色的(圖1a中白色箭頭所示)，而未萌發(fā)的孢子的會被染上紫紅色(圖1a中黑色箭頭所示).

2.2.4 根系分泌物的UPLC-MS分析 樣品的衍生和UHPLC-MS分析是基于Chen等的方案[17]. 根系分泌物的檢測使用：AB Sciex Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀與Agilent 1290超高效液相色譜儀和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(1.7 μm × 2.1 mm×100 mm). AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀能夠在控制軟件(Analyst TF 1.7, AB Sciex)控制下基于IDA功能進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集. 在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù). 轟擊能量：30 eV，每50 ms 15張二級譜圖. ESI離子源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓(GS1)：60 Psi，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5000 V(正離子模式)或-4000 V(負離子模式). 流動相包括溶劑A(25 mmol/L醋酸銨和25 mmol/L氨水)和溶劑B(乙腈). 以0.5 mL/min的流速梯度進行：溶劑A和B在0 min到0.5 min時分別保持5%和95%，溶劑A從0.5 min的5%線性增加到7 min的35%，到8 min的60%，并保持在60%直到9 min. 最后，溶劑A在9.1 min時降至5%，并保持在3%直到12 min. 溶劑B從0.5 min的95%線性下降到7 min的65%，到8 min的40%，并保持在40%直到9 min. 最后，溶劑A在9.1 min增加到95%，并保持在95%直到12 min. 使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始轉(zhuǎn)成mzXML格式. 再使用XCMS做保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，minfrac設(shè)為0，cutoff設(shè)為0.6. 與自建的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對峰進行物質(zhì)鑒定.

通過比較總離子色譜(TIC)進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，為了識別代謝物，我們對以下信息進行了綜合分析. (1)使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始轉(zhuǎn)成mzXML格式；(2)獲取標準化合物的準確質(zhì)荷比(m/z)和保留時間；(3)將上機的代謝物參數(shù)矯正和比對之后與數(shù)據(jù)庫進行比對和物質(zhì)鑒定；(4)ESI+和ESI-模式分別進行.

2.2.5 數(shù)據(jù)分析 對結(jié)果進行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal Projections to Latent Structures- Discriminant Analysis, OPLS-DA). 同時，對代謝物數(shù)據(jù)進行了對數(shù)轉(zhuǎn)換，以改善正態(tài)性，并進行了歸一化處理，用于統(tǒng)計分析. 對三個油菜材料進行分組，對于差異性代謝物的篩選，采用了學(xué)生T檢驗的P值和OPLS-DA模型的VIP值.P< 0.05，VIP> 1.

2.2.6 差異性代謝物的驗證 為了評估差異代謝物對休眠孢子萌發(fā)的影響，我們選擇了一些代謝物，如L-isoleucine, Amentoflavone, 2′-Deoxyuridine, Trigonelline, Thymine, Coumarin, Pyridoxal 5′-phosphate, D-lyxose，參照根系分泌物的方案測試不同次級代謝物刺激休眠孢子萌發(fā)的能力. 同時選取萌發(fā)率差異較大的兩種代謝物處理休眠孢子，進行根腫病表型實驗. 兩個試驗中使用的這些代謝物的濃度分別為2 mg/L、5 mg/L、5 mg/L、100 nmol/L、5 mg/L、3 mg/L、5 μmol/L、5 mg/L和3 mg/L，每個處理重復(fù)3次.

3 結(jié)果與分析

3.1 不同抗性材料根系分泌物誘導(dǎo)休眠孢子萌發(fā)

不同抗性材料的根系分泌物刺激休眠孢子萌發(fā)的效果有明顯差異. 在處理開始時(第0 d)，所有處理中約有0.97%的孢子在萌發(fā)，各處理之間沒有差異. 處理1 d后，R-197根系分泌物處理的孢子萌發(fā)率顯著高于華雙5R和Kc84-1根系分泌物處理及對照組(P≤ 0.05). 在第2～7 d，R-197根系滲出物刺激休眠孢子萌發(fā)的效率總是顯著高于華雙5R和Kc84-1根系分泌物處理及對照組(P≤ 0.05)(圖1b). 這些結(jié)果表明，與抗性材料相比，易感材料的根系分泌物中或許存在一些特有的或共有但含量較高的物質(zhì)導(dǎo)致了休眠孢子的大量萌發(fā).

王俊[3]等報道中良性結(jié)節(jié)血流分級主要為0～Ⅰ級，惡性結(jié)節(jié)血流分級主要為Ⅱ～Ⅲ級；相較于惡性結(jié)節(jié)，良性結(jié)節(jié)的血流信號豐富比率、RI和鈣化比率均更低，形態(tài)規(guī)則比率、邊界清晰比和暈環(huán)比率均更高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本次研究的診斷結(jié)果和其他報道基本一致，可行性高[4]。

3.2 代謝物的鑒定

從R-197、華雙5R和Kc84-1的根系分泌物中共鑒定出1257(ESI+)和1079(ESI-)種次級代謝物(用飛行時間和質(zhì)荷比(RT-m/z)表示). 為了區(qū)分三個樣品組，將ESI+(ESI-)中的1,257(1079)個代謝物進行PCA分析(圖2a, d)，三組樣品除R-197中的兩個樣品外都可明顯分開. 在所有的變量中，ESI+中61.38%(ESI-中56.23%)的模式與第一成分有關(guān)，ESI+中9.28%(ESI-中13.43%)與第二成分有關(guān)，區(qū)分了A、B和C(A、B、C分別代表華雙5R、Kc84-1和R-197). 為了可靠的組間差異和后續(xù)的可視化分析，采取了OPLS-DA，得分圖顯示三個樣本組之間有明顯的區(qū)別(圖2b, 2c, 2e, 2f).

圖1 根系分泌物對蕓薹屬根腫菌(P. brassicae)休眠孢子萌發(fā)的影響(a)水中培養(yǎng)1 d后，在顯微鏡下觀察到的休眠孢子，黑色箭頭和白色箭頭分別表示未萌發(fā)和萌發(fā)的孢子； (b)不同抗性材料的根系分泌物處理組和對照組中休眠孢子的萌發(fā)情況，誤差棒表示標準差Fig.1 Effect of root exudates on the germination of P. brassicae resting spores(a) Resting spores observed in the microscope after 1 day of incubation in water, black and white arrows indicate non-germinating and germinating spores, respectively; (b) germination of resting spores in the treated and control groups with different resistant materials root exudates, bars= SDs

3.3 差異性代謝物的篩選

為了尋找在刺激休眠孢子萌發(fā)中起重要作用的關(guān)鍵代謝物，分別對易感材料R-197與抗性材料華雙5R和Kc84-1進行了代謝物的分組比較. 在ESI+模式下，與華雙5R相比，R-197有120個代謝物含量上調(diào)，250個代謝物下調(diào)；與Kc84-1相比，中R-197有337個代謝物上調(diào)，180個代謝物下調(diào). 在ESI-模式下，與華雙5R相比，R-197中96個代謝物上調(diào)，243個代謝物下調(diào)；與Kc84-1相比，R-197中353個代謝物上調(diào)，142個代謝物下調(diào)(圖3). 差異顯著的次級代謝物如表1所示.

圖2 主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

表1 部分差異代謝物

圖3 差異代謝產(chǎn)物火山圖(Volcano plot)

3.4 差異代謝物功能驗證

為了驗證差異代謝物在刺激休眠孢子萌發(fā)方面的作用，我們選擇了一些差異代謝物單獨進行萌發(fā)試驗. 篩選原則如下：易感材料R-197與抗性材料華雙5R和Kc84-1之間存在許多差異性代謝物. 易感材料分別與兩種抗性材料進行比較得到兩個差異組，而這兩個組的差異代謝物分析表明，既有相同的，也有不同的，因此用于驗證的差異代謝物涵蓋了這兩類. 在萌發(fā)實驗中，孢子的初始萌發(fā)率為0.11%. 孵育前2 d，所有處理之間無明顯差異. 處理第4 d，L-Ile(L-isoleucine)和Trigonelline處理組的萌發(fā)率顯著升高(P≤ 0.05)(圖4). 處理第6 d，用不同的差異性代謝物處理的休眠孢子的萌發(fā)率差異更為明顯(P≤ 0.05). 除Arg組外，其他處理組的休眠孢子萌發(fā)率都與對照組均有顯著差異，且不同處理組間也有很大差異，這些結(jié)果說明Thymine，2′-Deoxyuridine，L-isoleucine，Trigonelline，Pyridoxal 5′-phosphate，Coumarin，D-lyxose和Amentoflavon等差異代謝物可以刺激休眠孢子的萌發(fā).

圖4 差異代謝物處理組和對照組中休眠孢子的萌發(fā)情況誤差棒表示標準差，顯著性使用單因素方差分析，圖基檢驗，P≤ 0.05，字母不同表示具有顯著性差異Fig.4 Germination of resting spores in the differential metabolite treatment and control groupsBars= SDs, significance was taken with one-way ANOVA, Tukey′s test, P≤ 0.05, different letters indicate significant difference

3.5 休眠孢子萌發(fā)率對根腫病發(fā)病的影響

為了進一步確認不同萌發(fā)率的孢子對根腫病發(fā)病的影響，我們分別選擇Arg和Thymine孵育到7 d時的休眠孢子懸液(萌發(fā)率分別是0.13%和71.2%)對抗性材料華雙5R接種，30 d后調(diào)查發(fā)病情況. 結(jié)果表明，接種低萌發(fā)率孢子懸浮液的華雙5R表現(xiàn)出較強的抗病特征，感病植株較少，且感病程度很低. 但使用高萌發(fā)率的孢子懸浮液接種，發(fā)病率達到了100%，且發(fā)病程度也很嚴重(圖5a, 5b). 因此，我們推斷，休眠孢子的萌發(fā)在根腫病發(fā)病過程中起重要作用：高萌發(fā)率導(dǎo)致高發(fā)病率. 另外，我們將易感材料R-197和抗性材料華雙5R種植在一起，并保證根系相互接觸，對照組則單獨種植. 30 d后調(diào)查了發(fā)病率. 結(jié)果表明，與對照組相比，捆綁種植的抗性材料發(fā)病率顯著增加. 這說明易感材料可以分泌出大量引起休眠孢子萌發(fā)的代謝物，致使根系周圍的休眠孢子萌發(fā)為具有極強侵染能力的初級游動孢子進而提高了根腫病的發(fā)病率和患病程度(圖5c).

圖5 休眠孢子萌發(fā)率對抗性材料抗病表型的影響

4 討 論

植物的根部可以合成、積累和分泌各種各樣的化合物，如氨基酸、有機酸、多糖和蛋白質(zhì)，這些化合物有的可以分泌到根系周圍，被稱為根系分泌物[18]. 遺傳背景是影響根系分泌物含量和種類的一個重要因素. 在我們的研究中，通過鑒定，并分別比較了兩個種不同的抗根腫病材料與易感根腫病材料的根系分泌物中的代謝物組分尋找可以刺激休眠孢子萌發(fā)的代謝物，如氨基酸、核苷、有機酸和激素等，這些代謝物也被稱為萌發(fā)刺激因子(GSFs)[19]. 此外，在比較兩組差異代謝物時，我們發(fā)現(xiàn)與易感材料相比，不同抗性水平的代謝物中存在一些特異的差異代謝物和一些相同的差異代謝物. 對于這些相同的差異性代謝物，兩組的差異倍數(shù)是不同的. 我們猜想，這些相同的差異代謝物更有可能是關(guān)鍵的萌發(fā)刺激因素，根腫菌孢子萌發(fā)驗證結(jié)果也證實了這一點. L-isoleucine, Amentoflavone, 2′-Deoxyuridine, Trigonelline和Thymine以及一些其他含量差異較大代謝物的作用或多或少都與微生物孢子或萌發(fā)作用有關(guān). 茉莉酸(JA)似乎被一些真菌病原體利用作為效應(yīng)物[20]. 2′-Deoxyuridine被確定為能夠促進稻瘟病真菌分生孢子侵染的活性分子[21].Trigonelline可能是微生物-植物共生或致病系統(tǒng)中的信號分子，在許多豆科植物根部分生組織的早期生長中起細胞周期調(diào)節(jié)器的作用[22，23]. 根瘤菌可以利用由其宿主Medicagosativa[24]合成的Trigonelline作為滲透保護劑和能量來源.Thymine是生物的一個重要化學(xué)組分，可以促進Scsbamaaculeata的結(jié)節(jié)，但高濃度的Thymine具有殺菌作用[25，26]. 香豆素化合物是植物合成的重要次級代謝物，它具有許多重要的生物功能，首先具有抗菌活性，其次，它也可以作為共生細菌、病原體和其他植物的信號分子[27].

在本研究中，與易感材料一起種植，抗性材料也普遍感染根腫病，在一定條件下，抗性材料的發(fā)病甚至可以達到與易感材料相當?shù)乃? 目前進行的抗性研究，大多是利用自然條件下篩選出的抗性材料，建立定位群體，定位主導(dǎo)抗病的抗性位點，而關(guān)于深層抗病機理的報道卻很少. 另一方面，對于篩選出的抗性材料，不同實驗室有不同甚至相反的結(jié)果. 原因很復(fù)雜，比如根腫菌繁多的生理小種、不同的接種方法、不同的培養(yǎng)條件等. 在我們的實驗中，將病原體、接種方法和培養(yǎng)環(huán)境等因素控制在相同，結(jié)果表明不同萌發(fā)率根腫菌孢子處理抗病材料，植株抗病性存在顯著差異. 由此推斷，根腫病的發(fā)生與休眠孢子的萌發(fā)率密切相關(guān). 一些研究發(fā)現(xiàn)，根腫病的發(fā)生也部分取決于土壤環(huán)境中休眠孢子的含量，也就是所謂的有效濃度，即只有根際的萌發(fā)孢子參與感染，易感材料的根可以分泌大量的物質(zhì)，觸發(fā)根腫菌休眠孢子的萌發(fā)，并導(dǎo)致有效孢子的含量增加，最終導(dǎo)致植株產(chǎn)生根腫. 而抗性材料的根系分泌物中這些物質(zhì)的含量較低甚至沒有，即使在休眠孢子含量極高的土壤中，由于萌發(fā)的有效孢子的含量較低，這些植株也能免于被侵染，表現(xiàn)出抗性. 當然，根腫病的抗性機制是多種多樣的，我們的研究也只是提供一個新的視角.

本研究首次采用UPLC-MS方法對根腫病抗性和易感材料植株的根系分泌物進行分析，篩選出一些差異代謝物，并確認一些代謝物可以有效刺激休眠孢子萌發(fā). 這些差異代謝物在很多方面都可能存在潛在的應(yīng)用前景. 例如，利用根系分泌物可開發(fā)出穩(wěn)定的化學(xué)藥劑，刺激休眠孢子的萌發(fā)，對帶菌田塊進行預(yù)處理，防治根腫??；另一方面，一些差異代謝物也可以開發(fā)成抗性育種的生物標志物. 植物根際是一個復(fù)雜的環(huán)境，不同代謝物在體外的穩(wěn)定性也是一個重要的影響因素，不同代謝物的性質(zhì)及作用驗證仍需要進一步研究.