蠶沙葉綠素不皂化物化學成分研究

畢敬豆， 穆怡含， 張鈺瑤， 李 靈 ， 鄧小寬， 高 平 ， 周鵬程 ， 蔣學瑛， 蔣小紅， 劉 競， 陳海瓊

(1.四川大學生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 成都 610065；2.四川省通世達生物科技有限公司 資陽市院士(專家)工作站， 資陽 641500)

1 引 言

蠶沙(Faeces Bombycis)，我國傳統蟲類中藥，始載于《名醫(yī)別錄》，是蠶蛾科家蠶屬昆蟲家蠶(BombyxmoriLinnaeus)幼蟲的干燥糞便[1,2].蠶沙是桑蠶產業(yè)的主要副產物之一，主產地有浙江、江蘇、四川等省份.《本草綱目》中記載[3]蠶沙具有祛風除濕、和胃化濕、清熱明目、活血定痛的功效.現代藥理研究表明蠶沙中的活性成分包括黃酮類、生物堿類、萜類、香豆素類等[4]，其提取物具有促進骨髓造血[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化、降低人體膽固醇含量[7]、降血糖[8]、抗炎[9]和鎮(zhèn)痛[10]等活性.臨床上蠶沙常作為治療糖尿病和類風濕性關節(jié)炎的常用藥物[11]，研究證明其主要降糖成分為1-脫氧野尻霉素，效果顯著.因此，該中藥具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值.

蠶沙中富含葉綠素，是食品工業(yè)中天然著色劑的良好來源[12].20世紀六七十年代研究者便開始利用蠶沙提取葉綠素，相比較從高等植物中提取葉綠素，蠶沙資源豐富，其中含量高達1%[13]，更易于工業(yè)化生產.在葉綠素生產過程中加堿皂化產生大量富含植物醇、類胡蘿卜素和葉黃素[14]等物質的不皂化物，有研究者對生產葉綠素及銅鈉鹽后所得廢液中的β-胡蘿卜素[15,16]、果膠[17]及黃酮類化合物[18]提取工藝進行了相關報道，但對其中單體化合物并未有深入研究，且目前國內外關于蠶沙葉綠素不皂化物中的化學成分未見相關研究報道.

目前國內企業(yè)年產葉綠素100噸以上，每年積累幾百噸不皂化物副產物，因此深入研究不皂化物中的化學成分具有重要意義.立足于蠶沙前期處理研究，本文重點探究蠶沙葉綠素不皂化物中的化學成分，為蠶沙資源的進一步綜合利用提供研究資料，為后續(xù)相關產品的生產工藝研究開發(fā)提供理論依據.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 原料 蠶沙葉綠素不皂化物(四川省通世達生物科技有限公司提供)；豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、羽扇豆醇對照品(成都植標化純生物技術有限公司).

2.1.2 試劑 石油醚(60～90)、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮(分析純，成都科龍化工試劑廠)，甲醇(色譜純，成都科龍化工試劑廠).

2.1.3 儀器 玻璃層析柱(150 mm×600 mm)；R201D真空旋轉蒸發(fā)儀(鞏義英峪高科儀器廠)；LC3000高效液相色譜儀(UV3000紫外檢測器、P3000高壓輸液泵，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；Sepax Sapphire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；MCI GEL(上海廈美生化科技發(fā)展有限公司)；制備色譜柱(YMC-C18-10μm，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；MicrOTOFQⅡ(德國Bruker公司)；Bruker AvanceⅡ-400MHz和Bruker AvanceⅡ-600MHz spectrometer(德國Bruker公司).

2.2 方 法

2.2.1 分離純化 取400 g蠶沙葉綠素不皂化物用適量石油醚加熱溶解，加入適量硅膠拌勻晾干，干法裝柱，干法上樣，敲擊柱體，保證色譜層平整緊實.層析柱分別用石油醚/乙酸乙酯體積比(100∶0、 50∶1、 20∶1、 5∶1、 2∶1、 0∶1)梯度洗脫.收集洗脫液，經TLC追蹤檢測合并相同餾分，減壓濃縮得到6個粗分段，分別為Fr.1(58 g)、Fr.2(42 g)、Fr.3(39 g)、Fr.4(24 g)、Fr.5(51 g)、Fr.6(15 g).Fr.1段石油醚結晶得到白色蠟狀固體，經C18中壓色譜柱分離得到高純度化合物11.Fr.2段二次過硅膠柱，TLC檢測回收得到Fr.2-A-D.經HPLC檢測分析，合并AB和CD，得到Fr.2-AB(8.6 g)、Fr.2-CD(12.86 g)先后通過MCI柱粗分離，甲醇洗脫；再重復多次經C18中壓色譜柱分離，90%～100%甲醇洗脫，Fr.2-CD得到化合物1(1.6 g)，Fr.2-AB得到化合物2(145 mg).Fr.3段經硅膠柱分離，得到含有7～9三個化合物含量較多的兩個粗組分Fr.3-A(19.67 g)和Fr.3-B(10.32 g).兩個分段經過C18中壓色譜柱和高壓制備色譜柱進行細分離，均用90%～100%甲醇梯度洗脫，經過反復柱層析分離，HPLC檢測，分別得到純度較高的化合物7(320 mg)、8(600 mg)和9(31 mg).Fr.4經過TLC、HPLC檢測對照品分析，富含甾醇類化合物3,4,5,6,10，先經MCI柱甲醇洗脫初步除雜，后進行C18中壓色譜柱分離得到Fr.4-A,B,C.Fr.4-A經C18中壓色譜柱，90%～100%甲醇洗脫，得到化合物3(1.39 g)，Fr.4-B經過多次C18中壓色譜柱和高壓制備色譜柱，90%～100%甲醇洗脫得到化合物10(73 mg)，Fr.4-C經過多次C18中壓色譜柱分離得到化合物4(43 mg),5(40 mg),6(78 mg).Fr.5用乙醇、丙酮等溶劑結晶可得到大量化合物6.Fr.6經HPLC檢測未發(fā)現含量較高的成分，故不再進行分離.

2.2.2 結構鑒定 本文通過分離純化和重結晶得到高純度的單體化合物，用氘代試劑溶解，利用質譜、核磁氫譜、碳譜等波譜技術進行測定.查閱文獻，根據波譜數據和化合物的理化性質進行結構鑒定.

3 化合物結構鑒定

化合物1：淡黃色油狀液體，ESI-MS at m/z:297.23[M-H]+.TLC結果顯示該化合物和植物醇標品的Rf值和斑點形狀一致.HPLC檢測結果顯示該化合物出峰時間與植物醇標品一致，且混合進樣顯示為同一物質，故化合物1鑒定為植物醇(Phytol)，分子式C20H40O.

化合物2：白色粉末，ESI-MS at m/z:427.98[M-H]+.1H-NMR(400HMz,DMSO)б:3.47(1H,t,J=3.11 Hz,H-3，-OH), 5.54、5.52 (1H,d,J=6 Hz,H-6,雙鍵質子氫),0.98～1.16(3H,s,取代甲基氫),1.31～1.84(1H,m,質子氫取代).13C-NMR (101 MHz, DMSO)δ:18.02(C-1)，27.98(C-2),74.36(C-3),40.14(C-4),142.65(C-5),118.86(C-6),19.07(C-7),46.82(C-8),34.04(C-9),49.53(C-10),32.62(C-11),29.53(C-12),38.67(C-13),35.47(C-14),28.93(C-15),34.24(C-16),29.83(C-17),42.50(C-18),34.09(C-19),27.9(C-20),32.60(C-21),37.27(C-22),27.76(C-23),28.93(C-24),15.87(C-25),19.07(C-26),17.93(C-27),29.53(C-28),32.14(C-29),31.63(C-30).以上核磁數據與文獻[19]基本一致，故化合物2鑒定為5-Glutinen-3-ol，分子式為C30H50O.

化合物3：白色羽狀結晶，ESI-MS at m/z:427.12[M-H]+.1H-NMR(400HMz,CDCl3)б:4.57(d，J=2.6 Hz,H-20a)；4.65(d，J=2.4 Hz,H-20b)；3.20(dd，J=11.5，5.0 Hz，H-3)，0.74～1.71(3H，s，取代甲基氫).13C-NMR (101 MHz, CDCl3)δ:38.72(C-1)，27.46(C-2),79.01(C-3),38.87(C-4),55.31(C-5),18.02(C-6),34.29(C-7),40.84(C-8),50.45(C-9),37.18(C-10),20.94(C-11),25.15(C-12)，38.06(C-13)，43.01(C-14),28.00(C-15),35.60(C-16),42.84(C-17),48.31(C-18),48.00(C-19),150.99(C-20),29.86(C-21),40.02(C-22),29.71(C-23),15.39(C-24),15.99(C-25),16.13(C-26),14.56(C-27),18.33(C-28),109.34(C-29),19.32(C-30).以上核磁數據與文獻[20]基本一致，故化合物3鑒定為羽扇豆醇(Lupeol)，分子式為C30H50O.

化合物4：白色粉末，ESI-MS at m/z:412.64[M-H]+.TLC結果顯示該化合物與豆甾醇標準品的Rf值和斑點形狀一致.HPLC檢測結果顯示該化合物的出峰時間與豆甾醇標準品一致，且混合進樣顯示是同一物質.故化合物4鑒定為豆甾醇(Stigmasterol)，分子式為C29H48O.

化合物5：白色粉末，ESI-MS at m/z:400.70[M-H]+.HPLC檢測結果顯示該化合物的出峰時間與菜油甾醇標準品一致，且混合進樣顯示為同一物質.故鑒定化合物5為菜油甾醇(Campesterol)，分子式C28H480.

化合物6：白色針狀結晶，ESI-MS at m/z:415.12[M-H]+.TLC結果顯示該化合物與β-谷甾醇標準品Rf值和斑點形狀一致.HPLC檢測結果顯示該化合物的出峰時間與β-谷甾醇標準品一致，且混合進樣為同一物質.故化合物6鑒定為β-谷甾醇(β-sitosterol)，分子式C29H50O.

化合物7：淡黃色油狀液體，ESI-MS at m/z:430.51[M-H]+.1H-NMR(400 MHz,CDCl3)б:4.22(1H,s,-OH),2.5(2H,t,J=6.5 Hz,H-4),2.15(3H,s,H-10),2.11(6H,s,H-5a,H-7a),1.25(3H,m,H-2a),0.85(6H,m,H-12′a,H-13′),0.82(3H,m,H-8′a),0.83(3H,m,H-4′a).13C-NMR(101 MHz,CDC13)δ:75.4(C-2)，23.7(C-2a)，32.1(C-3)，20.6(C-4)，117.5(C-4a),118.8(C-5),11.9(C-5a),144.7(C-6),121.0(C-7),12.3(C-7a),122.4(C-8),145.6(C-8a),11.5(C-8b),39.7(C-1′),24.8(C-2′),37.3(C-3′,C-5′),32.9(C-4′),21.2(C-6′),37.3(C-7′,C-9′),32.6(C-8′),24.5(C-10′),39.6(C-11′),28.0(C-12′),22.5(C-12′a),22.3(C-13′),19.8(C-4′a),19.7(8′a).以上核磁數據與文獻[21]基本一致, 故化合物7鑒定為α-生育酚 (α-tocopherol)，分子式為C29H50O2.

化合物8：淡黃色油狀液體，ESI-MS at m/z:416.54[M-H]+.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ：4.20(1H,s,6-OH),1,67 (2H,m,H-3), 2,68 (2H,t,J= 7.3 Hz,H-4), 6,37(1H,s, H-5), 1,22-1,28 (2H，m，H-1′2′3′5′6′7′9′10′11′),0,83 (1H,d,J=6.7 Hz,H-4′,H-8′,H-12′,H-13′),1,23 (3H,s,H-2),2,12 (3H,s,H-7),2,09 (3H,s,H-8).13C-NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 75.48(C-2),31.40(C-3),22.34(C-4),112.14(C-5),146.23(C-6),121.61(C-7),125.81(C-8),145.76(C-9),118.32(C-10),40.05(C-1′),21.03(C-2′),37.47(C-3′),32.70(C-4′),37.30(C-5′),24.46(C-6′),37.48(C-7′),32.82(C-8′),37.44(C-9′),24.82(C-10′),39.39(C-11′),28.00(C-12′),22.65(C-13′),24.10(CH3-C-2),11.92(CH3-C-7),11.88(CH3-C-8),19.68(CH3-C-4′),19.77(CH3-C-8′),22.74(CH3-C-12′).以上核磁數據與文獻[22]基本一致，故化合物8鑒定為γ-tocoferol，分子式C28H48O2.

化合物9：白色粉末，ESI-MS at m/z:427.7[M-H]+.1H-NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.44(1H,t,J=6.8 Hz,H-2),5.10(5H,t,J=7.1 Hz,H-6,H-10,H-11,H-18,H-22)，4.16(2H,d,J=6.9 Hz,H-1),2.09(10H,m,H-4,H-5,H-8,H-9,H-12),1.98(10H,m,H-13,H-16,H-17,H-20,H-21),1.67(3H,s,24-CH3),1.62(18H,s,C-3-CH3,C-7-CH3,C-11-CH3,C-15-CH3,C-19-CH3, C-23-CH3).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ:59.43(C-1),124.42,124.28,124.25,124.18,123.76,123.32(C-2,C-6,C-10,C-14,C-18,C-22),139.89,135.43,135.04,134.98,134.96,134.95(C-3,C-7,C-11,C-15,C-19,C-23),29.72,26.78,26.72,26.68,26.34(C-4,C-8,C-12,C-16,C-20),39.76,39.74,39.57(C-5,C-9,C-13,C-17,C-21),25.71(C-24),17.70,16.31,16.04,16.02(C-25,C-26,C-27,C-28,C-29,C-30).以上核磁數據與文獻[23]基本一致，故化合物9鑒定為(2E,6E,10E,14E,18E,22E)-3,7,11,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22- tetracosahexaen-1-ol，分子式為C30H50O.

化合物10：白色蠟狀固體,ESI-MS at m/z:427.6[M-H]+.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.31(1H,t,J=6.8 Hz,H-7),5.13(1H,t,J=6.5 Hz,H-24),3.27(1H,dd,J=4.6,10.7 Hz,H-3),1.69(3H,s,CH3-26),1.60(3H,s,CH3-27),0.98(3H,s,CH3-29),0.99(3H,s,CH3-30),0.90(3H,s,CH3-28),0.89(3H，s，CH3-21)，0.83(3H,s,CH3-19)，0.77(3H,s,CH3-18).13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ:37.2(C-1),25.36(C-2),79.27(C-3),38.97(C-4),50.62(C-5),23.95(C-6),117.79(C-7),145.90(C-8),48.91(C-9),34.94(C-10),18.15(C-11),33.96(C-12),43.53(C-13),51.28(C-14),33.82(C-15),28.48(C-16),53.23(C-17),22.09(C-18),13.11(C-19),35.80(C-20),18.60(C-21),35.16(C-22),27.61(C-23),125.14(C-24),130.96(C-25),25.75(C-26),17.68(C-27),27.69(C-28),14.74(C-29),27.32(C-30).以上核磁數據與文獻[24]基本一致，故化合物10鑒定為(13α,14β,17α,20R)-7,24-二烯羊毛甾烷-3-醇((13α,14β,17α,20R)-lanosta-7,24-diene-3-ol),分子式C30H50O.

化合物11：白色蠟狀固體，ESI-MS at m/z:256.0[M-H]+,1H-NMR (400MHz,CDCl3)δ:2.36(2H,t,J=7.5 Hz,H-2),1.65(2H,m,H-3),1.27～1.32(22H, m,H-4～14),1.34(2H,m,H-15),0.90(3H,t,J=6.5 Hz,H-16).13C-NMR(101 MHz,CDCl3)δ:179.6(C-1),34.1(C-2),24.6(C-3),29.8-29.0(C-4-C-13),31.8(C-14),22.6(C-15),14.2(C-16).以上核磁數據與文獻[25，26]基本一致，故化合物11鑒定為棕櫚酸(palmitic acid)，分子式為C16H32O2.

圖2 化合物1～11結構式Fig 2 Chemical structures of conpounds 1～11

4 討 論

經過分離純化和結構鑒定，從蠶沙葉綠素不皂化物中分離得到11種化合物，包括6種甾醇類物質，2種萜類物質，2種生育酚及棕櫚酸.其中化合物2,9,10為首次從蠶沙中分離得到.結果可知，蠶沙葉綠素不皂化物中富含甾醇類物質，其中，β-谷甾醇、豆甾醇是葉綠素不皂化物中兩種主要的植物甾醇；其次是菜油甾醇和羽扇豆醇，在眾多的研究報道[27-29]中已經證實了它們具有抗炎、抗腫瘤和降低膽固醇等多種良好的藥理活性，目前在食品、化妝品和醫(yī)藥領域都有著廣泛應用.最后，本文研究首次在蠶沙中分離出兩種新的甾醇類物質5-Glutinen-3-ol與(13,14,17,20R)-lanosta-7,24-diene-3-ol，對后續(xù)蠶沙中甾醇研究有著重要意義.

此外，維生素E是一種脂溶性維生素，有著抗氧化[30]、抗衰老[31]、預防動脈粥硬化等功效，蠶沙葉綠素不皂化物中分離的α-生育酚和γ-生育酚是維生素E的兩種天然存在形式.植物醇也是維生素K合成中的重要原料.因此，蠶沙葉綠素不皂化物可作為生產甾醇類物質和維生素E、維生素K的材料來源.本文研究明確了不皂化物相關化學成分，為蠶沙生產葉綠素過程中產生的相關副產物的深度利用提供了研究資料.