靈芝三萜和多糖提取工藝研究

李 波 張亞茹 周婭麗 張鵬輝，3 崔亞君 陳藏藏 李彥增

（1河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2河南省果蔬加工及質(zhì)量安全控制工程技術研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003；3河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司技術中心，河南漯河 462000；4河南世紀香食用菌開發(fā)有限公司，河南許昌 461100）

靈芝Ganoderma lucidum，是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，其主要功效成分包括多糖和三萜類物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。近年來，隨著靈芝人工栽培技術的成熟和推廣，靈芝產(chǎn)量大幅增長，開展靈芝的精深加工就顯得日益迫切和必要。其中，提取靈芝的功效成分，開發(fā)相關的功能產(chǎn)品是一條有效途徑。

有關靈芝三萜和多糖的提取方法已有報道，主要包括醇提法（三萜）、水提法（多糖）、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶提法等[2?3]。筆者綜合考慮提取效率和成本，對醇提法、水提法提取靈芝三萜和靈芝多糖的工藝進行優(yōu)化試驗，并與超聲波輔助提取法進行比較，以期為靈芝功效成分的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

靈芝（赤芝）子實體，由河南世紀香食用菌開發(fā)有限公司提供。齊墩果酸，購自北京庫爾科技有限公司。葡萄糖，購自天津市德恩化學試劑有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要設備：FW400 A傾斜式高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 靈芝粉的制備

新鮮靈芝子實體→洗凈曬干→75℃烘箱干燥8 h→粉碎→過0.425 mm篩→靈芝粉。

1.3 靈芝三萜的提取

1.3.1 乙醇體積分數(shù)試驗

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL不同乙醇體積分數(shù)（80%、90%、95%、100%），在60℃下提取60 min，研究乙醇體積分數(shù)對靈芝三萜提取率的影響。

1.3.2 提取溫度試驗

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL無水乙醇，分別在不同溫度（20℃、40℃、60℃、80℃）條件下提取60 min，研究提取溫度對靈芝三萜提取率的影響。

1.3.3 提取時間試驗

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL無水乙醇，在60℃下分別提取30 min、60 min、90 min、120 min，研究提取時間對靈芝三萜提取率的影響。

1.3.4 提取次數(shù)試驗

按最佳條件對靈芝提取，離心后沉淀加入乙醇進行二次提取，共提取3次。測定每次提取液中靈芝三萜的濃度，研究提取次數(shù)對靈芝三萜提取效果的影響。

1.3.5 超聲波輔助試驗

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL無水乙醇，在60℃下超聲波輔助，分別提取20 min、40 min、60 min、80 min，研究超聲時間對靈芝三萜提取率的影響。

1.4 靈芝多糖的提取

1.4.1 提取溫度試驗

稱取1 g靈芝粉，加入20 mL去離子水，在不同溫度條件下（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）提取60 min，研究提取溫度對靈芝多糖提取率的影響。

1.4.2 提取時間試驗

稱取1 g靈芝粉，加入20 mL去離子水，在90℃下 分 別 提 取 不 同 時 間（30 min、60 min、90 min、120 min），研究提取時間對靈芝多糖提取率的影響。

1.4.3 料液比試驗

稱取1 g靈芝粉，加入不同體積（10 mL、20 mL、30 mL）去離子水，在90℃下提取90 min，研究料液比對靈芝多糖提取率的影響。

1.4.4 提取次數(shù)試驗

按最佳條件對靈芝提取，離心后沉淀加入乙醇進行二次提取，共提取3次。測定每次提取液中靈芝多糖的濃度，研究提取次數(shù)對靈芝多糖提取效果的影響。

1.4.5 超聲波輔助試驗

稱取1 g靈芝粉，加入20 mL去離子水，在80℃下超聲波輔助，分別提取20 min、40 min、60 min、80 min，研究超聲時間長短對靈芝多糖提取率的影響。

1.5 靈芝三萜的測定

1.5.1 齊墩果酸標準曲線的繪制

在10 mL比色管中分別吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 0.1 mg/mL齊墩果酸標準溶液，高溫水浴將溶劑蒸干。向比色管中加入5%香草醛?冰乙酸溶液0.4 mL，再加入高氯酸1 mL，搖勻。將比色管置于60℃水浴保持15 min后取出，立即置冰浴中冷卻5 min，然后加冰乙酸5 mL稀釋，搖勻，測定其在548 nm處的吸光度值[4]。

1.5.2 靈芝三萜提取率的測定

將靈芝三萜提取液稀釋一定倍數(shù)，按上述方法測定其在548 nm處的吸光度，得出三萜的濃度。靈芝三萜提取率（%）=CV/m，式中：C是提取液中三萜的濃度（g/mL），V是提取液的體積（mL），m是所取靈芝粉的質(zhì)量（g）。

1.6 靈芝多糖的測定

1.6.1 葡萄糖標準曲線的繪制

以葡萄糖為標準單糖，采用苯酚硫酸法制作標準曲線，測定其在490 nm處的吸光度值[5]。

1.6.2 靈芝多糖提取率的測定

將靈芝多糖提取液稀釋一定倍數(shù)，按上述方法測定490 nm處的吸光度，得出多糖的濃度。靈芝多糖提取率（%）=CV/m，式中：C是提取液中多糖的濃度（g/mL），V是提取液的體積（mL），m是所取靈芝的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝三萜的提取

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對靈芝三萜提取率的影響

由圖1可知，乙醇體積分數(shù)越高，靈芝三萜提取率越高，無水乙醇的提取率可達0.74%。由此可見乙醇體積分數(shù)對靈芝三萜提取率有較大影響，無水乙醇提取效果最佳。

圖1 乙醇體積分數(shù)對靈芝三萜提取率的影響

2.1.2 提取溫度對靈芝三萜提取率的影響

由圖2可知，靈芝三萜提取率隨提取溫度升高而提高，提取溫度超過60℃后趨于平緩。從節(jié)能和成本等考慮，提取溫度以60℃為宜。

圖2 提取溫度對靈芝三萜提取率的影響

2.1.3 提取時間對靈芝三萜提取率的影響

由圖3可知，隨提取時間延長靈芝三萜提取率呈先上升后下降的趨勢，在60 min時達到峰值0.76%。這可能是由于長時間高溫處理會對靈芝三萜結(jié)構(gòu)造成破壞，導致提取率降低。綜合考慮，提取時間以60 min為宜。

圖3 提取時間對靈芝三萜提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對靈芝三萜提取率的影響

對靈芝三萜進行3次提取，提取率分別為0.79%、0.14%和0.02%。由此可見，對靈芝提取2次后，即可將絕大部分三萜提取出來。

綜上所述，靈芝三萜的最優(yōu)提取方法為：采用10倍無水乙醇，提取溫度60℃，提取時間60 min，提取2次。

2.1.5 超聲波輔助提取靈芝三萜

由圖4可知，隨超聲處理時間延長，靈芝三萜提取率呈上升趨勢，在60 min達最大值，之后反而下降。這可能是因為超聲波會產(chǎn)生空穴效應，有助于靈芝細胞壁的破裂，使三萜類物質(zhì)更容易溶解出來，從而提高提取率，但長時間超聲處理可能會破壞靈芝三萜的結(jié)構(gòu)，使提取率降低。因此，超聲提取時間以60 min為宜。

圖4 超聲時間對靈芝三萜提取率的影響

通過比較，超聲波輔助提取靈芝三萜的提取率為0.88%，高于傳統(tǒng)的乙醇提取法（0.73%），增幅達20.5%。由于超聲波輔助提取裝置已實現(xiàn)工業(yè)化，且能耗成本也不太高，因此靈芝三萜的提取可采用超聲波輔助提取的方法。

2.2 靈芝多糖的提取

2.2.1 提取溫度對靈芝多糖提取率的影響

由圖5可知，隨提取溫度升高靈芝多糖提取率逐漸增加，超過90℃后增速趨緩。為了節(jié)約能源和避免高溫對多糖結(jié)構(gòu)的破壞，提取溫度以90℃為宜。

圖5 提取溫度對靈芝多糖提取率的影響

2.2.2 提取時間對靈芝多糖提取率的影響

由圖6可知，隨提取時間延長靈芝多糖提取率呈上升趨勢，超過90 min后增幅變小。綜合考慮，提取時間以90 min為宜。

圖6 提取時間對靈芝多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對靈芝多糖提取率的影響

由圖7可知，加水量越多，靈芝多糖提取率越高，料液比超過1∶20后增幅趨緩。考慮加水量過多會增加后續(xù)的濃縮成本，因此料液比以1∶20為宜。

圖7 料液比對靈芝多糖提取率的影響

2.2.4 提取次數(shù)對靈芝多糖提取率的影響

對靈芝多糖進行3次提取，提取率分別為2.67%、0.34%和0.15%。由此可見，隨提取次數(shù)增加，能夠提取出來的多糖數(shù)量越來越少，第三次提取出的多糖量已經(jīng)很少。綜合考慮提取和后續(xù)的濃縮成本，提取次數(shù)以2次為宜。

綜上所述，熱水提取靈芝多糖的最優(yōu)工藝為：用90℃熱水提取90 min，料液比1∶20，提取2次。

2.2.5 超聲波輔助提取靈芝多糖

由圖8可知，隨超聲波處理時間的延長，靈芝多糖的提取率逐漸增高，超過60 min后多糖提取率基本趨于穩(wěn)定?？紤]能耗等因素，超聲處理時間以60 min為宜。

圖8 超聲時間對靈芝多糖提取率的影響

通過比較，超聲輔助提取的多糖提取率為2.75%，高于傳統(tǒng)的熱水提?。?.43%），增幅達13.2%。這可能是因為超聲波產(chǎn)生的空穴效應，有助于靈芝細胞壁的破裂和胞內(nèi)多糖的溶出，從而增強提取效果。

3 結(jié)論

靈芝三萜的最佳提取條件為：采用10倍無水乙醇，在60℃提取時間60 min，提取2次。靈芝多糖的最佳提取條件為：采用90℃熱水提取90 min，料液比1∶20，提取2次。按照上述提取方法，靈芝三萜的提取率為0.76%，靈芝多糖提取率為2.67%。采用超聲波輔助提取，靈芝三萜和多糖的提取率可分別增加20.5%和13.2%。研究為靈芝功效成分的提取方法提供有益參考。