離子色譜法同時(shí)測定烏梅中4種有機(jī)酸的含量

★夏雪琴 羅鈺穎 呂尚 金浩鑫 魏惠珍 饒毅（. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 0004；2.江西省藥品認(rèn)證審評(píng)中心 南昌 0046；.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 南昌 0006）

烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume（Seib.）Sieb.et Zucc. 的干燥近成熟果實(shí),是一種重要的藥食同源藥材，具有斂肺、生津等功效［1］，也常被應(yīng)用于保健食品中［2-3］。烏梅中藥配方顆粒是將烏梅藥材經(jīng)水提取制成一定規(guī)格僅供醫(yī)療機(jī)構(gòu)中醫(yī)臨床配方使用的制成品，具有新穎、便捷、有效的特點(diǎn)［4］。

烏梅中含有豐富有機(jī)酸，其中含量較高的是檸檬酸和蘋果酸［5］。有研究表明，烏梅及其制劑對(duì)多種細(xì)菌有體外抑制作用［6-7］。烏梅提取物中的有效成分檸檬酸能降低肺炎克雷伯菌莢膜多糖生物合成的轉(zhuǎn)錄水平而發(fā)揮抗菌作用［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，烏梅其所含的有機(jī)酸成分可能與加速過氧亞硝酸清除、減輕過氧化損傷等方面有關(guān)［9-10］。Anke S等［11］發(fā)現(xiàn)，延胡索酸鹽在清除炎癥過程中釋放的破壞性‘氧自由基’，是烏梅抗氧化作用的關(guān)鍵有機(jī)酸。

目前測定烏梅中的有機(jī)酸的方法主要有液相色譜法、離子色譜法等。液相色譜法雖有簡便、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，但有機(jī)酸極性較大，在反向硅膠色譜柱上不易洗脫，同時(shí)測定多種有機(jī)酸時(shí)，分離度較差［12-13］。國內(nèi)外雖已有離子色譜法將其同時(shí)分析數(shù)種有機(jī)酸的相關(guān)報(bào)道［14-15］，但同時(shí)檢測烏梅及烏梅配方顆粒中4種主要有機(jī)酸的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定烏梅及烏梅配方顆粒中檸檬酸、蘋果酸、草酸、延胡索酸4種有機(jī)酸含量，結(jié)合藥理分離提取有效的有機(jī)酸成分，為提高烏梅的使用效率以及為進(jìn)一步研究闡明烏梅有機(jī)酸成分藥理作用的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安ICS2100離子色譜儀、Dionex IonPacTM AS19型分離柱（250mm×4mm）、電導(dǎo)檢測器、抑制器、Chromeleon色譜工作站（美國Thermo公司）；AB104-N萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

檸檬酸（批號(hào)：100396-201603，含量100%）；延胡索酸（批號(hào)：111541-201803，含量99.4%）；草酸鈉AR（阿拉丁試劑）；L-蘋果酸（批號(hào)：190014-201302，含量100%）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

烏梅配方顆粒5501批（批號(hào)：B190805501）、烏梅配方顆粒5601批（批號(hào)：B190805601）、烏梅配方 顆 粒 5701批（ 批 號(hào)：B190805701）（ 江 西天施康中藥股份有限公司）；烏梅配方顆粒樣品1（批號(hào)：20190301S）、烏梅配方顆粒樣品2（批號(hào)：20190302S）、烏梅配方顆粒樣品3（批號(hào)：20190303S）、烏梅配方顆粒樣品4（批號(hào)：20200701S）（江西百神藥業(yè)股份有限公司）；烏梅藥材1號(hào)（產(chǎn)地：福建），烏梅藥材2號(hào)（產(chǎn)地：云南），烏梅藥材3號(hào)（產(chǎn)地：四川），烏梅藥材4號(hào)（產(chǎn)地：云南）。

2 方法

2.1 樣品前處理

2.1.1 烏梅藥材供試品溶液的制備精密稱取烏梅藥材粉末0.2 g（精確至0.000 1 g），置具塞錐形瓶中，精密加入超純水50 mL，加熱回流30 min，取出，放冷，濾紙過濾，再精密量取續(xù)濾液2 mL，置100 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度線，搖勻，即得。

2.1.2 烏梅配方顆粒供試品溶液的制備精密稱取烏梅配方顆粒0.2 g（精確至0.000 1 g），置具塞錐形瓶中，精密加入超純水50 mL，加熱回流30 min，取出，放冷，濾紙過濾，再精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度線，搖勻，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Dionex IonPacTM AS19型分離柱（250 mm×4 mm）；流動(dòng)相：KOH梯度淋洗液（程序見表1）；KOH淋洗液流速：1.00 mL/min；抑制電流：75 mA；電導(dǎo)檢測器檢測；進(jìn)樣量：25 μL，以峰面積定量。

表1 淋洗液梯度程序

3 結(jié)果

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 色譜柱的選擇考察了AS19和AS11兩種色譜柱的分離效果，兩者的離子交換功能基基均為烷醇季銨基，親水性較強(qiáng)，對(duì)OH-的選擇性強(qiáng)。但AS11的柱容量小僅有45 μmol /柱；而AS19柱的柱容量高，為350 μmol /柱，對(duì)二價(jià)有機(jī)酸、蘋果酸、草酸等的保留較強(qiáng)，峰形較好，有利于實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)分離。實(shí)驗(yàn)證明AS11對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果較 AS19差，特別是對(duì)弱保留組分。故實(shí)驗(yàn)選用AS19分析柱。

3.1.2 淋洗液與梯度的優(yōu)化以 KOH 作淋洗液，OH-為強(qiáng)親水性離子，容易進(jìn)入固定相的水合區(qū)，有效地從離子交換位置上置換其他陰離子［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用KOH作淋洗液。以EG40淋洗液自動(dòng)發(fā)生器由純水在線生成高純度的KOH淋洗液，可以避免雜質(zhì)污染，保證淋洗液濃度準(zhǔn)確，從而最大限度地降低梯度淋洗導(dǎo)致的基線漂移，使得流速、淋洗液濃度在儀器可承受的范圍內(nèi)變化時(shí)，基線能始終保持平直，且平衡時(shí)間短。

由于不同有機(jī)酸與固定相的親和力差異大，采用等濃度淋洗會(huì)出現(xiàn)多種組分共淋洗或強(qiáng)保留組分洗脫時(shí)間過長的現(xiàn)象。為使4種有機(jī)酸在一定時(shí)間內(nèi)能完全淋洗，須采用梯度洗脫。本文以單標(biāo)進(jìn)樣并逐漸提高淋洗液濃度的方式考察了 4種有機(jī)酸的洗脫情況，發(fā)現(xiàn)最易洗脫的乳酸和乙酸在淋洗液濃度為4 mmol /L 時(shí)能得到完全分離的尖銳峰形；淋洗液濃度為54 mmol /L 時(shí)，檸檬酸和異檸檬酸能較快被洗脫。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定淋洗液濃度梯度程序如表 1 所示。在該淋洗條件下，4 種有機(jī)酸可實(shí)現(xiàn)基線分離。圖1為4種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。

3.1.3 流速的選擇分別設(shè)定淋洗液的流速為0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著淋洗液液流速的不斷增大，分離時(shí)間逐漸縮短，但對(duì)分離度影響不大。隨著流速的增大，柱壓升高，柱壓過高會(huì)損害色譜柱。因此，綜合考慮選擇流速為1.0 mL/min。

3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別稱取檸檬酸對(duì)照品26.06 mg、延胡索酸對(duì)照品7.86 mg、草酸鈉對(duì)照品8.70 mg、L-蘋果酸對(duì)照品9.77 mg，分別溶于4個(gè)100 mL容量瓶中，加入超純水至刻度，作為各樣品的標(biāo)準(zhǔn)液，濃度分別為 0.047 7、0.007 9、0.008 7、0.009 8 mg/mL。 用上述標(biāo)準(zhǔn)液分別加入1、2、5、8、10 mL的延胡索酸、草酸、L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液和2、5、10、25、20 mL檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液于5個(gè)50 mL容量瓶中，加入超純水至刻度。得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品混合溶液，在“1.3”的色譜條件下進(jìn)樣。

以峰面積為縱坐標(biāo)Y，各組分的質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果顯示被測組分的峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，且線性范圍寬，該方法對(duì)有機(jī)酸檢測顯示了較高的靈敏度。

表2 4種有機(jī)酸的線性回歸結(jié)果

3.3 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液，在“1.3”的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），L-蘋果酸、草酸、延胡索酸、檸檬酸的RSD分別為0.47%、2.66%、1.23%、1.86%，表明該方法具有較好的精密度。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品0.2g，按照“1.2”方法制備供試液。在 0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣 1 次，進(jìn)樣量 25 μL，L-蘋果酸、草酸、延胡索酸和檸檬酸5次進(jìn)樣峰面積的RSD分別為0.82%，2.59%，2.51%，0.11%。表明烏梅提取液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，稱取5份，精密稱定，按照“1.2”方法制備供試液。進(jìn)樣量為25μL，L-蘋果酸、草酸、延胡索酸和檸檬酸5次進(jìn)樣峰面積的RSD分別為1.03%，2.10%，2.05%，1.25%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.6 樣品測定結(jié)果

選用烏梅配方顆粒以及烏梅藥材進(jìn)行有機(jī)酸的測定，將烏梅配方顆粒以及烏梅藥材按照“1.2”方法處理后測定，計(jì)算4種有機(jī)酸的含量。見表3。樣品離子色譜圖見圖1。

圖1 各樣品HPLC色譜圖

表3 4種有機(jī)酸的含量 mg/g

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的種烏梅藥材或中藥配方顆粒樣品0.1g，共6份，每份按1∶1分別準(zhǔn)確加入“2.2”項(xiàng)下L-蘋果酸、草酸、延胡索酸和檸檬酸對(duì)照品適量，按照“1.3”色譜條件進(jìn)樣測定，分別計(jì)算加樣回收率。見表4。

表4 4種有機(jī)酸的加樣回收率（n=6）

4 討論

結(jié)果表明，不同公司生產(chǎn)的烏梅配方顆粒以及不同產(chǎn)地的烏梅藥材中4種有機(jī)酸含量差別很大，其中檸檬酸含量最高。該方法具有簡單、快速、靈敏度高，適合于快速測定烏梅藥材及配方顆粒中L-蘋果酸、草酸、延胡索酸和檸檬酸含量，結(jié)合藥理分離提取有效的有機(jī)酸成分，具有提高烏梅的使用效率以及研究闡明烏梅有機(jī)酸成分藥理作用的機(jī)制等實(shí)際意義。該方法中L-蘋果酸、草酸、延胡索酸和檸檬酸4種有機(jī)酸分離度良好，適合于快速測定烏梅、青梅等富含有機(jī)酸的藥材及食材，能夠?yàn)檫M(jìn)一步開發(fā)烏梅等富含有機(jī)酸的藥材及食材提供可靠的科學(xué)依據(jù)。