奶粉中香蘭素甲基香蘭素和乙基香蘭素UPLC-MS/MS 法的不確定度評(píng)定

陳海南，周建峰

（溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測科學(xué)研究院，浙江溫州 325000）

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素是行業(yè)中重要的廣譜型高檔香料，是目前全球產(chǎn)量最大的香料之一，具有清甜的豆香、粉香氣息，可用作定香劑、協(xié)調(diào)劑及調(diào)味劑，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品、日用化學(xué)品及醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。作為天然香料，廣泛存在與自然界中，甲基香蘭素、乙基香蘭素則是化學(xué)合成物質(zhì)，3 種物質(zhì)均有濃烈奶香味，具有增進(jìn)食欲、提高食品品質(zhì)、恢復(fù)食品香味、強(qiáng)化特征味道及消殺食品中不良味道的效果。

目前研究指出，過量食用香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素可以導(dǎo)致頭暈、惡心、嘔吐、呼吸困難，甚至能夠損傷肝、腎，對(duì)人體健康有較大危害[3]。在食用奶粉最大的嬰兒群體中，研究數(shù)據(jù)顯示過多食用添加香蘭素等添加劑的奶粉后，會(huì)使嬰兒對(duì)其產(chǎn)生依賴性，時(shí)間越長、吃得越多，小嬰兒或?qū)⒏兹旧掀场⑻羰?、厭食等不良飲食?xí)慣，使得攝入營養(yǎng)不全。

國家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布實(shí)施的GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]明確指出不得添加任何食用香料、香精有27 種食品，其中包括巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、無水黃油、稀奶油和嬰幼兒配方乳粉等多種乳制品，而且規(guī)定，0～6 個(gè)月的嬰幼兒配方食品不得添加任何食品用香料，香蘭素在嬰幼兒谷類輔助食品中可以使用[5]，但最大使用量不得超過7 mg/100 g，美國食品香料與萃取物制造者協(xié)會(huì)（FEMA）建議軟飲料中香蘭素的用量為6.3 mg/100 g。國家企業(yè)信用信息公示系統(tǒng)顯示，2020 年12 月，國家市場監(jiān)督管理總局在單一批次雅培一款0～6 月齡1 段嬰兒配方奶粉的抽檢中檢出極微量香蘭素，香蘭素項(xiàng)目實(shí)測值為171.6 μg/kg。經(jīng)過調(diào)查，造成涉事批次產(chǎn)品香蘭素不合格的原因是雅培集團(tuán)愛爾蘭工廠在生產(chǎn)線更換品種生產(chǎn)時(shí)，對(duì)生產(chǎn)管道清洗不徹底，致使生產(chǎn)管道中殘留了前序產(chǎn)品含有的香蘭素，造成涉事批次產(chǎn)品香蘭素成分污染[6-7]。

目前，對(duì)香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素沒有相應(yīng)的國家檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法，只有地方標(biāo)準(zhǔn)《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定BJS 201705》[8]。國內(nèi)對(duì)于該3 種香料的研究，也有許多研究已經(jīng)涉及并開發(fā)檢測方法，有對(duì)植物油中的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測定[1]，有對(duì)于米粉中香蘭素和乙基香蘭素含量的測定[9]，有氣相色譜法測定椰子汁或復(fù)原椰子汁中5 種香料等[10]。對(duì)于香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的含量測定[11-22]，除了必要的檢測方法外，還需要關(guān)注測量結(jié)果的不確定度。現(xiàn)可查閱的文獻(xiàn)只有一篇關(guān)于氣相色譜質(zhì)譜法測定奶粉中香蘭素的不確定度評(píng)估[23]，且不涉及另外2 種香蘭素香味劑。因此，依據(jù)CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[24]、JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評(píng)定》[25]、JJF 1059.1—2012《測量不確定度評(píng)定與表示》[26]和地方標(biāo)準(zhǔn)《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定BJS 201705》，研究了奶粉中的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素含量的不確定進(jìn)行測定和分析，為準(zhǔn)確測定奶粉中香味劑含量提供更加科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉，市售；香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）；甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；正己烷，色譜純；氯化鈉，分析純；水為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水；孔濾膜（孔徑為0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜），上海安譜公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1290/6470 型三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，配ESI 源，美國安捷倫公司產(chǎn)品；IKA MS3型渦旋振蕩器，德國IKA 公司產(chǎn)品；SIGMA3K15 型冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥5 000 r/min），美國Sigma 公司產(chǎn)品；Research Plus 型微量移液器，德國艾本德公司產(chǎn)品；Millipore 型超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司產(chǎn)品；SK5200H 型超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器公司產(chǎn)品；HCB1002 型分析天平，艾德姆衡器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.00 mg/mL）。分別稱取香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素0.1 g；（精確至0.000 1 g）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。于-18 ℃下避光保存。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別吸取上述3 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL 于同一個(gè)100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋到刻度配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-18 ℃下避光保存。

（3）空白基質(zhì)溶液。按照前處理方法操作制備空白基質(zhì)溶液。

（4）基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。分別準(zhǔn)確吸取香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用空白基質(zhì)提取液將其稀釋為10，20，40，80，160 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，臨用時(shí)現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

稱取1 g 樣品（精確至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入3 mL 水，渦旋振蕩30 s，加入7 mL 乙腈，渦旋振蕩30 s，超聲處理25 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min 后，取上層清液2 mL 于10 mL 玻璃離心管中，加入1 mL 正己烷，渦旋混合30 s，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心3min 后，取下層清液，過濾膜（0.22 μm，有機(jī)相），待分析。

1.3.3 儀器分析參考條件

（1）液相部分設(shè)置。色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），美國安捷倫公司產(chǎn)品；液相流速0.3 mL/min；柱溫箱溫度30 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；流動(dòng)相A 為甲醇；流動(dòng)相B 為含0.1%甲酸的水；程序洗脫條件為0～0.5 min，75% A；0.5～2.0 min，75%→50% A；2～6 min，50%A；6～7 min，50%→10% A；7～9 min，10% A；9～12 min，10%→75%。

（2）質(zhì)譜部分設(shè)置。離子源：電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子掃描（ESI+），檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4 不確定度數(shù)學(xué)模型的組建

待測組分含量計(jì)算：

式中：X——待測組分含量，μg/kg；

C——待測組分在標(biāo)準(zhǔn)曲線中所得溶液質(zhì)量濃度，ng/mL；

V——定容體積，mL；

m——稱量樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析檢測過程不確定度的因素

分析整個(gè)測定過程，對(duì)奶粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素測量值的不確定度影響因素如下：樣品稱量Urel(A)，樣品提取過程Urel(B)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度Urel(C)，標(biāo)準(zhǔn)溶液稱量稀釋過程Urel(D)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合Urel(E)，重復(fù)性測量Urel(F)，測量回收率Urel(G)，測量儀器Urel(H)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成表示為：

2.2 不確定度因素的分析

2.2.1 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度

檢測方法使用百分之一的天平作為稱量設(shè)備（艾德姆衡器電子天平HCB1002），檢測方法中要求稱取1 g 樣品，稱量天平由溫州計(jì)量院檢定，證書編號(hào)為（CA210105758），該證書提供的允許誤差為±0.01 g，在分布均勻的條件下，=0.005 77，稱量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：=0.005 77。

2.2.2 樣品提取過程產(chǎn)生的不確定度

該檢測方法在提取過程中涉及的準(zhǔn)確體積量為3 mL 水和7 mL 乙腈，最終定容體積可視為10.0 mL。檢測過程使用10.0 mL 移液管，由溫州計(jì)量院檢定，證書編號(hào)為（CA210610218），最大允許誤差為±0.05 mL。由移液管移取過程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為=0.003 849 1，=0.001 649 6。已知水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.4×10-3℃-1，測量實(shí)驗(yàn)室的溫度為20±5 ℃，依據(jù)95%置信概率條件（k=1.96），在提取過程中溫度影響產(chǎn)生的不確定度為：

由樣品提取過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品提取過程產(chǎn)生的不確定度：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度產(chǎn)生的不確定度

由香蘭素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，純度為99.9%，當(dāng)k=2 時(shí)在95%置信區(qū)間上擴(kuò)展不確定度U=0.5%，則產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.002 50；而由甲基香蘭素證書和乙基香蘭素證書提供的純度分別為99.4%和99.9%，當(dāng)k=2 時(shí)在95%置信區(qū)間上擴(kuò)展不確定度分別為U=2%和U=0.5%，可以得出產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制稀釋過程產(chǎn)生的不確定度

計(jì)算香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制稀釋過程的不確定因素：

（3）三次配制，配制成香蘭素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列曲線工作液。用200 μL 移液器分別移取10，20，40，80，160 μL，將1.0 μg/mL 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間工作液定容到1 mL 容量瓶里，并用空白基質(zhì)定容，得到10，20，40，80，160 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。200 μL 移液器需要使用5 次，1 mL 容量瓶使用5 次。依據(jù)JJG 646—2006《移液器 檢定規(guī)程》[28]的要求，按矩形分布計(jì)算，則香蘭素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列曲線工作液配制產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液配制產(chǎn)生的不確定度見表2。

表2 系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液配制產(chǎn)生的不確定度

通過3 次配制過程，產(chǎn)生的香蘭素配制稀釋過程的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由以上香蘭素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算過程可以得出甲基香蘭素和乙基香蘭素的配制稀釋過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel(D甲基香蘭素)和Urel(D乙基香蘭素)為0.022 068 58。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液10，20，40，80，160 ng/mL的各個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)，同一個(gè)質(zhì)量濃度分別測定3 次，5 個(gè)濃度點(diǎn)計(jì)5×3=15 次，依據(jù)最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3 種物質(zhì)的3 條線性回歸方程：Y=aX+b。對(duì)待測樣品的重復(fù)測定次數(shù)為6 次，則擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線產(chǎn)生的不確定度為：

式中：S——單一峰響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

a——擬合曲線斜率；

b——擬合曲線截距值；

n——擬合曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)的測定次數(shù)；

X——被測樣品的濃度最佳估計(jì)值；

X——標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)濃度點(diǎn)的平均值；

Xi——標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度點(diǎn)的值；

Y——標(biāo)準(zhǔn)曲線中各濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的峰面積響應(yīng)值。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線點(diǎn)濃度-峰面積響應(yīng)值對(duì)應(yīng)表見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線點(diǎn)濃度-峰面積響應(yīng)值對(duì)應(yīng)表

后續(xù)得到曲線，5 個(gè)點(diǎn)計(jì)15 個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)測定數(shù)的峰面積響應(yīng)值，代入公式得出香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.6 重復(fù)性測量產(chǎn)生的不確定度

在相同的測量條件下，對(duì)6 份空白奶粉樣品做600.0 μg/kg 水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液添加測量試驗(yàn)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定。

重復(fù)性測量結(jié)果和測量回收率見表4。

表4 重復(fù)性測量結(jié)果和測量回收率

依據(jù)貝塞爾（Besssel）公式，合成重復(fù)性測量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：Xi——測量值；

S(Xi)——標(biāo)準(zhǔn)偏差；

n-1——自由度。

由表4 可計(jì)算出Urel(F香蘭素)=0.012 798 40，Urel(F甲基香蘭素)=0.013 123 36，Urel(F乙基香蘭素)=0.022 175 51。

2.2.7 測量回收率產(chǎn)生的不確定度

依據(jù)2.2.6，在600.0 μg/kg 水平對(duì)6 份空白奶粉樣品進(jìn)行加標(biāo)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定，得到測量回收率結(jié)果。依據(jù)貝塞爾（Besssel）公式，合成測量回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：ri——回收率值；

S(Ri)——標(biāo)準(zhǔn)偏差；

n-1——自由度。

由此可以由表格X 計(jì)算出Urel(G香蘭素)=0.012 816 684，Urel(G甲基香蘭素)=0.013 101 677，Urel(G乙基香蘭素)=0.022 107 853。

2.2.8 測量儀器產(chǎn)生的不確定度

Agilent1290/6470 三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的校準(zhǔn)證書（CB201004144）提供的不確定度U=2%，k=2，按照正態(tài)分布，其產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel(H)=0.010。

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度因素的評(píng)定

2.3.1 合成總相對(duì)不確定度

由上述分析各個(gè)因素的相對(duì)不確定度公式，計(jì)算合成奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素含量測定結(jié)果的總相對(duì)不確定度。

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的各因素相對(duì)不確定度見表5。

表5 香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的各因素相對(duì)不確定度

2.3.2 擴(kuò)展不確定度和測定結(jié)果

測試試驗(yàn)結(jié)果，最后測試加標(biāo)盲樣，香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素測定含量為100.0 μg/kg，依據(jù)取包含因子k=2，置信概率為95%時(shí)，香蘭素的擴(kuò)展不確定度為Urel(X香蘭素)=C×k×Urel=100.0×2×0.035 57=7.1 μg/kg；甲基香蘭素的擴(kuò)展不確定度為Urel(Y甲基香蘭素)=C×k×Urel=100.0×2×0.037 91=7.6 μg/kg；乙基香蘭素的擴(kuò)展不確定度為Urel(Z乙基香蘭素)=C×k×Urel=100.0×2×0.042 16=8.4 μg/kg。由上述可得出，奶粉中香蘭素的含量表示為100.0±7.1 μg/kg，甲基香蘭素的含量表示為100.0±7.6 μg/kg，乙基香蘭素的含量表示為100.0±8.4 μg/kg，k=2。

4 結(jié)論

測試依據(jù)檢測方法對(duì)不確定因素的來源展開分析并對(duì)各分因素不確定度進(jìn)行具體計(jì)算，由表5 可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液稱量稀釋過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為第一影響因素，其次是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合、重復(fù)性測量和測量回收率產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，其余的樣品稱量、樣品提取過程、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度及測量儀器產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均比較低。為了提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)該在系統(tǒng)誤差恒定的情況下，盡可能地在配制曲線上下重心，配制合適范圍的線性曲線，在實(shí)際檢測過程中，通過選擇穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，增加校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測試步驟，并對(duì)樣品進(jìn)行平行測定，定時(shí)對(duì)天平設(shè)備和檢測設(shè)備進(jìn)行維護(hù)校準(zhǔn)，減少過程中的不確定度，并加強(qiáng)檢測人員的試驗(yàn)操作規(guī)范化和熟練度。