牛奶中多西環(huán)素殘留消除及最大殘留限量

孔伶俐，林翠萍，陸毅興，姚雪軍，勞華杰，曾東平* (.華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院 廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣東 廣州 5064；.華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心

(廣州)，廣東 廣州 510642)

多西環(huán)素(doxycycline)是一種四環(huán)素類廣譜抗生素，又稱脫氧土霉素、強力霉素，體內(nèi)外抗菌活性優(yōu)于土霉素和四環(huán)素[1]。多西環(huán)素內(nèi)服后吸收迅速，具有生物利用度高、組織滲透力強、體內(nèi)分布廣、半衰期長等特點[2-3]。其對革蘭陽性菌、陰性菌、以及支原體等均有抑制作用，近年來亦可用于治療水生動物疾病，如魚的弧菌病、愛德華菌病和氣單胞菌病等[4-5]。為保障動物性食品安全，我國規(guī)定了多西環(huán)素在豬、牛、家禽和魚可食性組織的最大殘留限量，其中奶牛泌乳期和家禽產(chǎn)蛋期禁用[6]。

目前我國已批準鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑用于預防奶牛產(chǎn)后感染，治療由敏感菌引起的子宮內(nèi)膜炎、子宮蓄膿、子宮炎和宮頸炎等。由于我國不允許多西環(huán)素用于泌乳期奶牛，尚未制定牛奶中多西環(huán)素最大殘留限量，鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑的使用是否對牛奶的安全和人類的健康產(chǎn)生潛在的危害尚未可知。本研究通過查閱和調(diào)研糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)、國際食品法典委員會(CAC)及歐洲藥品管理局(EMA)等國際性組織和美國等發(fā)達國家制定動物性食品中多西環(huán)素最大殘留限量研究方法，依據(jù)我國動物性食品中多西環(huán)素最大殘留限量的規(guī)定，開展鹽酸多西環(huán)素在牛奶中的殘留消除，制定牛奶中多西環(huán)素最大殘留限量，為牛奶安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑，含量規(guī)格：按C22H24N2O8計算24 g∶2 g，批號20191006，購自華秦源(北京)動物藥業(yè)有限公司；鹽酸多西環(huán)素對照品(含量85.2%)，批號K0131209，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鹽酸多西環(huán)素-d3，含量97.0%，批號20191112，購自Toronto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，購自美國Thermo Fisher公司；乙二胺四乙酸二鈉，分析純，購自南京化學試劑有限公司；三氟乙酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙酸乙酯，均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.2 主要儀器設備Agilent1200型高效液相色譜儀，購自6430串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；高速臺式冷凍離心機，購自德國Eppendorf公司；氮吹濃縮儀，購自廣州飛迪生物科技有限公司；旋渦混合器，購自上海青浦瀘西儀器廠；數(shù)控超聲波清洗器，購自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；兩用型隔膜真空泵，購自天津市津騰實驗設備有限公司；Oasis HLB固相萃取柱：60 mg，3 mL。

1.3 實驗動物健康成年荷斯坦奶牛20頭，高產(chǎn)和低產(chǎn)奶牛各10頭，由內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟烏蘭浩特市某牧場提供。試驗前不給予任何藥物，采用散欄飼養(yǎng)方式，主要飼喂干草粗飼，每日飼喂2次，自由飲水，臨床觀察1周。

1.4 牛奶中多西環(huán)素殘留消除

1.4.1給藥與樣品采集 產(chǎn)后的奶牛給藥前用3%的新潔爾滅溶液沖洗肛門部及外陰周圍，然后用75%酒精棉球?qū)﹃幍肋吘壖皟?nèi)側(cè)進行消毒，根據(jù)臨床推薦給藥劑量和給藥時間，采用給藥1次，1支/次。給藥前采集空白牛奶，停藥后分別于6，12，24，48，72，96，120，144和168 h清洗乳區(qū)，對奶頭進行消毒，擠凈每頭奶牛4個乳區(qū)的奶，并置于同一容器內(nèi)使成為混合奶，從中取100 mL于聚丙烯瓶中，密封，做好標記，-20℃保存。

1.4.2樣品前處理 參考國家標準的方法并做修改[7]。稱取(5±0.01) g試樣于50 mL聚丙烯離心管中，用0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液溶解并定容至40 mL，渦旋混合1 min，冰水浴超聲10 min，轉(zhuǎn)移至50 mL聚丙烯離心管中，冷卻至0～4℃，5 000 r/min離心10 min，用快速濾紙過濾，待凈化。

準確吸取4 mL提取液以1滴/s的速度過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇水淋洗，棄去全部流出液，2.0 kPa以下減壓抽干5 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯洗脫。40℃下將洗脫液氮吹濃縮至干，用1.0 mL 10%甲醇+三氟乙酸溶液溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4.3液相色譜條件 色譜柱為C8柱(150 mm ×2.1 mm，粒徑5 μm，美國Phenomenex公司)；流動相：A：0.01 mol/L三氟乙酸溶液；B：甲醇；梯度洗脫程序見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：26℃；進樣體積：5 μL。

表1 流動相梯度洗脫梯度

1.4.4質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)，正離子掃描，多反應監(jiān)測，毛細管電壓：4 000 V，霧化氣流速：9 L/min，霧化氣溫度：350℃，多西環(huán)素和多西環(huán)素-d3的主要參考質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 多西環(huán)素和多西環(huán)素-d3的質(zhì)譜參數(shù)

1.4.5基質(zhì)標準曲線的制備 空白牛奶按照1.4.2的方法處理，制得到空白牛奶基質(zhì)溶液，準確量取多西環(huán)素和多西環(huán)素-d3標準工作液適量，分別用空白基質(zhì)溶液配制成多西環(huán)素濃度為2.5,5.0,12.5,25.0,50.0,125.0和250.0 μg/L，多西環(huán)素-d3濃度均為25.0 μg/L的系列基質(zhì)匹配標準溶液，臨用現(xiàn)配，供LC-MS/MS測定。

1.4.6檢測限和定量限的測定 取空白牛奶添加不同濃度多西環(huán)素標準工作液，配制成一系列低濃度空白添加樣品，按上述樣品處理的方法處理。以信噪比(S/N)≥3時所對應的添加濃度為檢測限(LOD)，S/N≥10時所對應的添加濃度為定量限(LOQ)。

1.4.7回收率和變異系數(shù)的測定 取空白牛奶樣品加入多西環(huán)素標準工作液和多西環(huán)素-d3工作液，制備5，10和20 μg/kg 3個濃度的空白牛奶添加樣品。按照1.4.2、1.4.3、1.4.4的樣品分析方法進行處理，并經(jīng)儀器檢測，每個濃度設6個重復，連續(xù)重復3批，采用單點定量法，計算不同添加濃度下的回收率、批內(nèi)精密度和批間精密度。

1.4.8樣品測定 每頭奶牛每個時間點的奶樣都進行2個平行處理，結(jié)果以兩者平均值表示，同時設置空白牛奶和空白添加藥物進行對照，記錄藥物和內(nèi)標的峰面積，帶入標準曲線回歸方程計算牛奶中鹽酸多西環(huán)素的殘留量。

1.4.9數(shù)據(jù)分析 每頭奶牛每個時間點取2個平行樣檢測結(jié)果的平均值作為最終檢測結(jié)果，使用WTM1.4軟件，計算棄奶期。

1.5 牛奶中多西環(huán)素殘留最大殘留限量

1.5.1每日允許攝入量 歐盟和我國規(guī)定多西環(huán)素的ADI為0～3 μg/kg，1個體質(zhì)量60 kg的人每日允許攝入量為180 μg。

1.5.2殘留標示物 歐盟和我國規(guī)定動物性組織中多西環(huán)素的殘留標示物為多西環(huán)素，牛奶中多西環(huán)素殘留標識物與總殘留的比值為1。

1.5.3最大殘留限量 我國和歐盟制定了多西環(huán)素最大殘留限量，牛(泌乳期禁用)，肌肉100 μg/kg，脂肪300 μg/kg，肝臟300 μg/kg，腎臟600 μg/kg；豬，肌肉100 μg/kg，皮+脂300 μg/kg，肝臟300 μg/kg，腎臟600 μg/kg；家禽，肌肉100 μg/kg，皮+脂300 μg/kg，肝臟300 μg/kg。

1.5.4理論最大日攝入量 歐盟要求不同動物品種的理論最大日攝入量(TMDI)不得超過ADI。歐盟EMA規(guī)定1個體質(zhì)量60 kg的人每日食物消費系數(shù)為：肌肉300 g，肝臟100 g，腎臟50 g，脂肪50 g，奶1 500 g，雞蛋100 g，蜂蜜50 g。按照歐盟EMA理論最大日攝入量計算，肌肉、脂肪、肝臟和腎臟中多西環(huán)素的每日攝入量分別為30，15，30和30 μg，總計為105 μg，占多西環(huán)素ADI的58%。

1.5.5MRL的外推 基于上述基礎，采用EMA建議的MRL外推方法制定牛奶中多西環(huán)素最大殘留限量。肌肉、肝臟、脂肪和腎臟可食性組織中多西環(huán)素的理論最大日攝入量相當于ADI的58%?？紤]到四環(huán)素類其他藥物已批準用于奶牛、蛋雞和魚，因此，將多西環(huán)素剩余ADI的42%用于制定牛奶、蛋和魚中的最大殘留限量并計算理論最大日攝入量。

2 結(jié)果

2.1 牛奶中多西環(huán)素殘留消除

2.1.1色譜分離 空白牛奶按1.4.2方法處理后將空白牛奶基質(zhì)和空白牛奶基質(zhì)加入一定濃度多西環(huán)素標準工作液和多西環(huán)素-d3溶液的樣品進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，多西環(huán)素標準溶液、空白牛奶、空白牛奶提取液添加多西環(huán)素及多西環(huán)素-d3工作溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1～3。由圖可知，空白樣品中無干擾峰，藥物的出峰時間為17.9 min左右。

圖1 多西環(huán)素標準溶液(0.05 mg/L)多反應監(jiān)測色譜圖

圖2 空白牛奶基質(zhì)和空白牛奶基質(zhì)添加多西環(huán)素-d3(50 μg/kg)多反應監(jiān)測色譜圖

圖3 空白牛奶基質(zhì)添加多西環(huán)素(50 μg/kg)和多西環(huán)素-d3(50 μg/kg)多反應監(jiān)測色譜圖

2.1.2標準曲線和線性范圍 多西環(huán)素在牛奶中的線性范圍為5～500 μg/kg，線性方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示。

表3 標準曲線回歸方程與相關(guān)系數(shù)

2.1.3檢測限和定量限 按信噪比(S/N)≥3為檢測限(LOD)，S/N≥10為定量限(LOQ)。求得方法在牛奶中的檢測限為2.5 μg/kg，定量限為5 μg/kg。

2.1.4回收率和變異系數(shù) 多西環(huán)素在牛奶的回收率以及批內(nèi)、批間變異系數(shù)見表4。在5,10和20 μg/kg 3個添加濃度的回收率為86.7%～95.9%，批內(nèi)、批間相對標準偏差分別小于7.1%,5.5%。

表4 空白牛奶中添加多西環(huán)素的回收率和變異系數(shù)(n=6)

2.1.5牛奶中多西環(huán)素殘留消除 各時間點牛奶中多西環(huán)素殘留量如表5所示。停藥后6,12,24,48,72 h，20頭奶牛的牛奶樣品均檢測出多西環(huán)素，藥物濃度在8～270 μg/kg。停藥后96 h，18頭奶牛的牛奶樣品檢測出多西環(huán)素，藥物濃度在6～71 μg/kg。停藥后120 h，14頭奶牛的牛奶樣品檢測出多西環(huán)素，藥物濃度在6～25 μg/kg。停藥后144 h，9頭奶牛的牛奶樣品檢測出多西環(huán)素，藥物濃度為6～25 μg/kg。停藥后168 h后，僅1頭奶牛的牛奶樣品檢測出多西環(huán)素，質(zhì)量濃度為9 mg/L。

表5 停藥后不同時間牛奶樣品中多西環(huán)素的濃度 μg/kg

2.2 牛奶中多西環(huán)素最大殘留限量制定

2.2.1MRL的外推 對于已建立ADI的獸藥，如果藥物的代謝與已知在有關(guān)動物的代謝行為類似，則將ADI值按比例分配到全部組織+蛋/奶，根據(jù)WHO推薦的食物消費系數(shù)，推導出各種組織和蛋/奶的MRL。如果藥物的代謝與已知動物的代謝特征不同，則應進行靶動物殘留標示物消除試驗后建立MRL。多西環(huán)素已確定ADI，且其藥物的代謝與已知在有關(guān)動物的代謝行為類似，所以多西環(huán)素的最大殘留限量按照前者進行計算。

按照歐盟EMA理論最大日攝入量計算，肌肉、脂肪、肝臟和腎臟中多西環(huán)素的每日攝入量分別為30，15，30和30 μg，總計為105 μg(相當于每日攝入量的58%)，剩余75 μg(相當于每日攝入量的42%)，用于制定牛奶、雞蛋和蜂蜜中的最大殘留限量。由于EMA顯示每位消費者每日的牛奶消耗量為1 500 g，考慮到牛奶中標志物占總殘留量的比率為1，建議牛奶中多西環(huán)素最大殘留限量為10 μg/kg，其每日攝入量為15 μg，人體日攝入總量為120 μg，占每日攝入量的67%。結(jié)果見表6。

表6 多西環(huán)素理論最大日攝入量

2.2.2鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑在奶牛的休藥期 使用軟件WTM1.4，選取20頭奶牛的停藥后12,24,48,72,96,120,144和168 h共8個時間點進行計算，結(jié)果顯示W(wǎng)T值為206，建議棄奶期為9 d。

3 討論

3.1 牛奶中多西環(huán)素殘留消除國內(nèi)外關(guān)于多西環(huán)素在豬、雞和魚的殘留相關(guān)研究已有不少報道[8-10]，但在奶牛的研究較少。本研究開展的鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑在牛奶中殘留消除試驗表明，在停藥后12 h，多西環(huán)素在牛奶中的藥物濃度最高，可達270 μg/kg，停藥后144 h，9頭奶牛的牛奶樣品檢測出多西環(huán)素，藥物濃度為6～25 μg/kg。停藥后168 h后，僅1頭奶牛的牛奶樣品檢測出多西環(huán)素，質(zhì)量濃度為9 mg/L。這比文獻報道的多西環(huán)素在豬、雞等可食性組織的濃度低，殘留消除快，其可能的原因是該制劑經(jīng)子宮給藥，主要用于局部治療，全身吸收較少[11-13]。

3.2 牛奶中多西環(huán)素最大殘留限量目前，國外已有關(guān)于已制定?？墒承越M織最大殘留限量的獸藥外推制定牛奶最大殘留限量的研究報道。EMA報道了硝碘酚腈、三氯苯達唑、氯舒隆、碘醚柳胺在牛奶中最大殘留限量的評估報告[14-17]。本研究參考上述方法制定多西環(huán)素在牛奶中的最大殘留限量。多西環(huán)素的微生物學ADI為3 μg/kg(即180 μg/人)。我國已經(jīng)規(guī)定多西環(huán)素在?？墒承越M織中的MRL，肌肉100 μg/kg，脂肪300 μg/kg，肝臟300 μg/kg，腎臟600 μg/kg，占ADI的58%。多西環(huán)素的殘留標示物與總殘留的比值為1。本研究沒有將剩余42%的ADI用于奶中最大殘留限量的制定，考慮到多西環(huán)素可能批準用于蛋雞和蜜蜂，所以建議牛奶中多西環(huán)素的最大殘留限量為10 μg/kg(加上可食性組織相當于ADI的67%)，剩余33%的ADI可用于雞蛋和蜂蜜中最大殘留限量的制定。

3.3 鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑在牛奶中的棄奶期本研究采用EMA推薦的WTM1.4棄奶期計算軟件，以95%可信限為標準，計算鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑在牛奶中的棄奶期。結(jié)果表明，鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑在牛奶中的棄奶期為9 d。我國批準鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑的休藥期，牛28 d，棄奶期7 d。本研究計算的棄奶期與我國批準的鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑較一致。

綜上所述，建議參照歐盟多西環(huán)素?？墒承允称分凶畲髿埩粝蘖客馔频脚Ｄ讨凶畲髿埩粝蘖糠椒?，將每日允許攝入量按比例分配到全部組織+奶，推薦牛奶中多西環(huán)素的最大殘留限量為10 μg/kg，采用WTM 1.4 軟件計算鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑在牛奶中殘留棄奶期為9 d。