NLRP3在介導(dǎo)小鼠皮膚傷口修復(fù)過程中的作用

趙佳敏，李茜如，高飛菲，鞏志國，顧柏臣，白云潔，劉 博

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，在介導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。根據(jù)環(huán)境不同，巨噬細(xì)胞可分化為不同的表型[1]。例如，IL-4和IL-13的刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞，其特征包括精氨酸酶(Arginase)活性的顯著增強和幾丁質(zhì)酶3樣分子(Ym1)表達(dá)的上調(diào)；LPS可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為具有細(xì)胞毒性以及殺傷病原作用的M1型巨噬細(xì)胞[2]。精氨酸在M1型和M2型巨噬細(xì)胞中的代謝通路不同。在M1型巨噬細(xì)胞中，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)將精氨酸轉(zhuǎn)化為NO和瓜氨酸；在M2型巨噬細(xì)胞中，Arginase將精氨酸水解為鳥氨酸和尿素[3]。有文獻報道，NOS和Arginase在RAW 264.7巨噬細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)[4-5]。巨噬細(xì)胞Arginase活性的上調(diào)有利于傷口中膠原蛋白的合成[6]。此外，在動物創(chuàng)傷模型中，M1型巨噬細(xì)胞可通過誘導(dǎo)型NOS介導(dǎo)的NO釋放以維持正氮平衡，進而調(diào)節(jié)膠原形成和細(xì)胞增殖并促進傷口愈合[7]。在巨噬細(xì)胞從M1型向M2型極化的過程中，IL-10因其在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的重要調(diào)控作用而受到廣泛的關(guān)注。IL-10是促進組織修復(fù)的重要因子，其在創(chuàng)面邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞和浸潤的單核細(xì)胞中均有表達(dá)[8]。

在免疫細(xì)胞中，NLRP3(NLR pyrin domain-containing 3)可被細(xì)菌、毒素、顆粒物和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)等微生物和非微生物因素的刺激所激活[9]。其被認(rèn)為是天然免疫系統(tǒng)中重要的傳感器和受體之一，在宿主抵御病原體感染和識別其他危險相關(guān)信號所誘發(fā)的天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用[10]。有文獻報道，NLRP3炎性小體參與巨噬細(xì)胞的極化過程[11]。例如，NLRP3炎性小體的激活有助于糖尿病人的傷口愈合，而且在輕度創(chuàng)傷性腦損傷中也具有潛在的促進組織修復(fù)作用[12-13]。肌成纖維細(xì)胞可以通過產(chǎn)生巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor，M-CSF)促進單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，并且在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化和促進傷口組織修復(fù)過程中發(fā)揮了重要的作用[14]。但目前，NLRP3在小鼠肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)骨髓源巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)極化調(diào)節(jié)分子和傷口修復(fù)中是否發(fā)揮一定作用尚不明確。

本試驗通過使用肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)骨髓源巨噬細(xì)胞，從而探討NLRP3對骨髓源巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)極化調(diào)節(jié)分子和傷口修復(fù)的影響。通過動物試驗以及免疫熒光進一步探討NLRP3對小鼠皮膚傷口修復(fù)的影響。上述試驗可為闡明模式識別受體NLRP3在動物傷口修復(fù)中發(fā)揮的具體作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品使用的試劑和藥品：胎牛血清(FBS)購自Excell Biology公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；小鼠IL-10 ELISA試劑盒購自Biolegend公司；總NO檢測試劑盒購自Beyotime公司；Triton X-100和1 mol/L Tris-HCl(PH=7.5)均購自Solarbio公司；氯化錳、尿素、L-精氨酸和2-異亞硝基苯丙酮均購自Sigma-Aldrich公司；IL-4、IL-13和M-CSF均購自Peprotech公司；TNF-β購自Biolegend公司；兔抗Ym1多克隆抗體購自Stemcell Technologies公司；鼠抗Arginase單克隆抗體購自SANTA公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自Cell Signaling Technology公司；雙敏化學(xué)發(fā)光試劑購自Affinity Biosciences公司；Alexa Fluor 488偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司；Alexa Fluor 647偶聯(lián)的驢抗大鼠IgG二抗購自Abcam公司。

1.2 實驗動物野生型C57BL/6J小鼠購自南京大學(xué)模型動物研究所，NLRP3基因敲除小鼠購自美國杰克遜實驗室。本試驗使用8～10周齡，體質(zhì)量20 g左右的健康小鼠開展試驗。

1.3 小鼠耳皮膚來源的肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)使用文獻[14]方法分離野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3-/-鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞。下列分離獲得的組織和細(xì)胞均置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將鼠耳剪碎，在0.25%胰蛋白酶-EDTA中消化1 h。將鼠耳組織碎片置于含DMEM/F12培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2～5 d，隨后使用顯微鏡進行觀察，判斷在組織周圍是否游離出成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)2周后，將成纖維細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用含有TGF-β(終質(zhì)量濃度100 ng/L)和10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 d，以誘導(dǎo)其分化為肌成纖維細(xì)胞。隨后更換培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)試驗。

1.4 小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化使用文獻[15]方法分離野生型C57BL/6J小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞。下列分離獲得的細(xì)胞均置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用PBS緩沖液從小鼠股骨和脛骨中沖洗出骨髓，使用含有M-CSF(終質(zhì)量濃度20 μg/L)和20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d。隨后使用IL-4(終質(zhì)量濃度20 μg/L)和IL-13(終質(zhì)量濃度20 μg/L)刺激巨噬細(xì)胞48 h，誘導(dǎo)其分化為M2型巨噬細(xì)胞；使用LPS(1 mg/L)刺激M2型巨噬細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)其分化為M1型巨噬細(xì)胞。

1.5 Arginase活性檢測將巨噬細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含有M-CSF的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)并培養(yǎng)細(xì)胞8 d后加入IL-4和IL-13刺激48 h，以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化。用PBS沖洗細(xì)胞1次，加入0.1% Triton 100 μL/孔，置于搖床上室溫震蕩15 min，以裂解細(xì)胞，隨后加入50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、100 μL/孔和100 mmol/L MnCl2、10 μL/孔。吸取96孔板中的混合液100 μL于1.5 mL離心管中，56℃孵育7 min，然后加入0.5 mol/LL-精氨酸100 μL/管，37℃孵育15 min。孵育完成后加入終止液(H3PO4∶H2SO4∶H2O=1∶3∶7)800 μL/管終止反應(yīng)，隨后加入6% 2-異亞硝基苯丙酮40 μL/管，混勻；95℃孵育30 min，完成后4℃孵育30 min，取200 μL上述混合液于96孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測D540nm值。

1.6 ELISA檢測體外培養(yǎng)野生型C57BL/J小鼠和NLRP3基因敲除小鼠的耳皮膚來源肌成纖維細(xì)胞，收集肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液(myofibroblast conditioned medium，MFbCM)。在C57BL/J野生型小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞中加入IL-4、IL-13和野生型C57BL/6J小鼠耳皮膚來源肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液(C57BL/6J MFbCM)或NLRP3基因敲除小鼠耳皮膚來源肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液(NLRP3-/-MFbCM)，處理巨噬細(xì)胞48 h。隨后使用LPS刺激巨噬細(xì)胞24 h，同時設(shè)置LPS不刺激實驗組，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按照ELISA試劑盒說明書方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10的分泌水平。

1.7 NO含量檢測同1.6處理巨噬細(xì)胞后，僅收集使用LPS刺激后的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，隨后按照總NO檢測試劑盒說明書方法檢測細(xì)胞上清液中NO的含量。

1.8 Western blot分析使用Western blot方法對樣本中蛋白表達(dá)的水平進行分析。在本試驗中，Ym1一抗稀釋比例為1∶1 000，二抗稀釋比例為1∶7 500。

1.9 動物試驗隨機選取野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除鼠，各分為6組，每組10只，使用異氟烷對小鼠進行麻醉，剃除背毛后用75%酒精對皮膚進行消毒。固定小鼠，使用直徑約6 mm的圓形打孔器在小鼠背部做1個圓形創(chuàng)口，將小鼠單獨安置在可以自由飲食飲水且溫度、濕度和晝夜節(jié)律正常的環(huán)境中，使其皮膚傷口自然愈合。分別在第0，3，5，7，10及14天拍照并記錄傷口的愈合情況[16]。

1.10 傷口表面積的測定在皮膚創(chuàng)傷后第0，3，5，7，10和14天采集傷口照片，使用圖像分析工具Image J處理圖像，數(shù)據(jù)表示為傷口面積。

1.11 免疫熒光法檢測創(chuàng)傷組織中Ym1和Arginase的表達(dá)將-80℃低溫保存的小鼠皮膚創(chuàng)傷組織移至4℃環(huán)境下緩慢解凍，制作小鼠皮膚創(chuàng)傷組織冰凍切片(6 μm)，使用冷丙酮固定10 min。固定完成后切片在含0.25%吐溫的冷PBS中清洗3次，每次10 min。室溫下使用含有5%牛血清白蛋白的封閉液孵育1 h。隨后加入兔抗Ym1多克隆抗體(1∶50)和鼠抗Arginase單克隆抗體(1∶100)，在4℃避光條件中孵育過夜。孵育完成后，用含0.25%吐溫的PBS洗滌3次，每次15 min，然后使用Alexa Fluor 488偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗和Alexa Fluor 647偶聯(lián)的驢抗大鼠IgG在室溫條件下避光孵育1 h。使用共聚焦顯微鏡進行圖像采集(Zeiss LSM 800，×200倍)，統(tǒng)計激光共聚焦所示的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 NLRP3對M1型巨噬細(xì)胞NO含量及IL-10表達(dá)分泌的影響在巨噬細(xì)胞中加入IL-4、IL-13以及C57BL/6J MFbCM或NLRP3-/-MFbCM，48 h 后使用LPS刺激巨噬細(xì)胞，經(jīng)過24 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測NO含量及IL-10分泌量。試驗結(jié)果表明(圖1)，C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/-MFbCM均可上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞中NO含量，且C57BL/6J MFbCM上調(diào)現(xiàn)象更為顯著(P<0.001)。C57BL/6J MFbCM可顯著上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞中IL-10分泌量(P<0.001)。相反，NLRP3-/-MFbCM可顯著下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞IL-10分泌量(P<0.001)。上述結(jié)果表明，NLRP3-/-MFbCM對M1型巨噬細(xì)胞NO含量及IL-10分泌水平均具有影響。

圖1 C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/- MFbCM對M1型巨噬細(xì)胞NO含量(左)及IL-10分泌量的影響(右)

2.2 NLRP3對M2型巨噬細(xì)胞Arginase活性及IL-10表達(dá)分泌的影響在巨噬細(xì)胞中加入IL-4、IL-13以及C57BL/6J MFbCM或NLRP3-/-MFbCM，48 h后檢測巨噬細(xì)胞中Arginase活性及IL-10表達(dá)量。結(jié)果表明(圖2)，C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/-MFbCM均可上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞中Arginase活性，且C57BL/6J MFbCM上調(diào)現(xiàn)象更為顯著(P<0.001)。C57BL/6J MFbCM顯著上調(diào)M2巨噬細(xì)胞中IL-10分泌量(P<0.001)，而NLRP3-/-MFbCM對M2型巨噬細(xì)胞中IL-10表達(dá)分泌無顯著影響。上述結(jié)果表明，NLPR3在激活M2型巨噬細(xì)胞Arginase過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清對M2型巨噬細(xì)胞IL-10的表達(dá)分泌具有上調(diào)作用，且上述誘導(dǎo)作用的正常實現(xiàn)依賴于肌成纖維細(xì)胞中NLRP3的存在。

圖2 C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/- MFbCM對M2型巨噬細(xì)胞Arginase活性(左)及IL-10分泌量的影響(右)

2.3 NLRP3在M2型巨噬細(xì)胞Ym1表達(dá)中的作用在巨噬細(xì)胞中加入IL-4、IL-13以及C57BL/6J MFbCM或NLRP3-/-MFbCM，48 h后檢測巨噬細(xì)胞Ym1蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明(圖3)，在IL-4和IL-13處理巨噬細(xì)胞后，NLRP3-/-MFbCM處理的巨噬細(xì)胞中Ym1表達(dá)水平與C57BL/6J MFbCM相比處于較低水平(P<0.001)。上述結(jié)果表明，NLRP3參與了肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞Ym1的表達(dá)。

圖3 C57BL/6J MFbCM(左)和NLRP3-/- MFbCM(右)對M2型巨噬細(xì)胞Ym1表達(dá)的影響

2.4 野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除鼠背部傷口愈合情況在傷口的愈合的第0，3，5，7，10和14天分別比較野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除鼠背部傷口的愈合情況。由表1所示結(jié)果可知，與C57BL/6J相比，NLRP3基因敲除鼠創(chuàng)面收縮率顯著降低。結(jié)果表明，相比于野生型C57BL/6J小鼠，NLRP3基因敲除鼠傷口收縮遲緩(表1)。在皮膚損傷后第5和7天，野生型C57BL/6J小鼠創(chuàng)面收縮率顯著高于NLRP3基因敲除鼠(P<0.001)。在皮膚損傷后第14天，野生型C57-BL/6J小鼠背部傷口基本完全愈合，而NLRP3基因敲除鼠傷口周邊仍有少量壞死結(jié)痂(圖4)。上述結(jié)果表明，NLRP3功能的缺失對皮膚傷口修復(fù)產(chǎn)生不利影響。

表1 不同天數(shù)中不同小鼠背部創(chuàng)面面積變化情況 mm2

2.5 創(chuàng)傷組織中Arginase和Ym1表達(dá)情況在野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3-/-鼠背部傷口愈合情況試驗中，分析小鼠創(chuàng)面組織中Ym1和Arginase的表達(dá)情況。結(jié)果表明(圖5)，相比與NLRP3-/-小鼠，野生型C57BL/6J小鼠創(chuàng)面組織中Ym1和Arginase的表達(dá)均出現(xiàn)顯著上升(P<0.001)。此外，在第5天最為明顯(P<0.001)。上述結(jié)果表明，NLRP3的缺失對小鼠皮膚創(chuàng)面組織中Ym1和Arginase的表達(dá)具有下調(diào)作用。

Ym1.幾丁質(zhì)酶3樣分子；Arginase.精氨酸酶；DAPI.細(xì)胞核染色；Merge.合成圖(200×)

3 討論

研究表明，NLRP3炎性小體有助于皮膚損傷后早期炎癥階段的發(fā)生，且NLRP3參與巨噬細(xì)胞極化過程[11]。此外，當(dāng)細(xì)菌感染時，NLRP3表達(dá)的缺失會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞前列腺素合成分泌水平顯著下降，而前列腺素是參與傷口修復(fù)反應(yīng)過程中的關(guān)鍵脂質(zhì)介質(zhì)[17-18]。因此，本課題組初步推測NLRP3表達(dá)缺失可能對肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)的骨髓源巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)極化調(diào)節(jié)分子和傷口修復(fù)過程產(chǎn)生不利影響。結(jié)果顯示(圖1)，NLRP3可促進M1型巨噬細(xì)胞NO含量及IL-10分泌量，但該調(diào)控作用的發(fā)揮必須依賴于肌成纖維細(xì)胞中NLRP3的存在。在肌成纖維細(xì)胞NLRP3功能缺失的情況下，反而會導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞IL-10的分泌量出現(xiàn)顯著下調(diào)現(xiàn)象，進而對傷口修復(fù)過程產(chǎn)生不利影響。在IL-4和IL-13不存在的情況下，無論NLRP3功能是否完整，肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液對M2型巨噬細(xì)胞IL-10的表達(dá)分泌均無顯著影響(圖2)。在M2型巨噬細(xì)胞中，Ym1的表達(dá)與Arginase活性試驗結(jié)果具有一致性(圖3)。上述結(jié)果表明，在M1型巨噬細(xì)胞中，NO含量及IL-10分泌量均依賴于NLRP3功能的完整；在M2型巨噬細(xì)胞中，在肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液的誘導(dǎo)下Arginase活性顯著增強，Ym1表達(dá)上調(diào)，進而共同促進組織修復(fù)和傷口愈合的過程，且該調(diào)控作用依賴于NLRP3。因此，推測NLRP3可能在小鼠皮膚傷口的愈合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

為了探究NLRP3在傷口修復(fù)過程中與巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)極化調(diào)節(jié)分子中的作用是否具有關(guān)聯(lián)。建立野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除小鼠背部創(chuàng)傷模型[16](圖4)，分析創(chuàng)傷組織中Ym1和Arginase的表達(dá)(圖5)。本課題組發(fā)現(xiàn)，NLRP3功能的缺失顯著減緩小鼠皮膚傷口的愈合速度，且創(chuàng)傷組織中Ym1和Arginase的表達(dá)情況發(fā)生與細(xì)胞水平相同的變化。

綜上所述，模式識別受體NLRP3對小鼠肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)的骨髓源巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)極化調(diào)節(jié)分子和傷口修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本試驗可為以NLRP3為靶點的，具有促進傷口修復(fù)功能的獸醫(yī)臨床藥物開發(fā)與應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。然而，NLRP3通過何種途徑對肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)極化調(diào)節(jié)分子和皮膚傷口愈合過程進行調(diào)控目前尚未明確，還需在未來的研究工作中加以探討。