胞內(nèi)勞森菌TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

劉昌錦，魏黃思梧，胡換儀，肖 童，林 敏，劉小蘭，邊彥超，羅 峰，鄧舜洲*

(1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西金伊博生物科技有限公司，江西 南昌 330013)

豬增生性腸炎(porcine proliferative enteropathy，PPE)又稱豬回腸炎，是由專性胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintracellularis，L.intracellularis)引起的豬的接觸性傳染病，以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細(xì)胞發(fā)生根瘤樣增生為特征[1]。PPE首次報(bào)道于1931年，目前在全球主要養(yǎng)豬國家均有流行[2]?；加蠵PE的豬只呈兩種臨床表現(xiàn)，慢性感染引起豬小腸腺瘤病(porcine intestinal adenomatosis,PIA)臨床表現(xiàn)間歇性下痢，精神沉郁，日增重降低，致死率較低，通常發(fā)生于4月齡以下豬只；急性感染也稱增生性出血性腸病(proliferate haemorrhage enteritis，PHE)，以出血性下痢和急性發(fā)病死亡為特征，多見于4月齡以上的成年豬[3]。PPE產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)影響受地區(qū)和臨床表現(xiàn)不同而存在差異，但無可爭議的是，高L.intracellularis感染率會(huì)顯著影響豬群的生長發(fā)育狀況和降低飼料利用率，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

L.intracellularis是脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)勞森菌屬(Lawsonia)的唯一成員，抗酸染色顯紅色，呈直桿狀或弧形，菌長1.25～1.75 μm,寬0.25～0.45 μm，是典型的具有3層外膜的革蘭陰性菌，無纖毛和孢子，在細(xì)胞培養(yǎng)分離的某些菌群中觀察到單獨(dú)的一根長的極性鞭毛，與菌體在共培養(yǎng)細(xì)胞外運(yùn)動(dòng)相關(guān)。由于其嚴(yán)苛的微需氧生長環(huán)境和專性的胞內(nèi)寄生特性，常規(guī)細(xì)菌病原鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)——分離培養(yǎng)并不適用于臨床診斷。L.intracellularis多數(shù)情況下呈亞臨床感染，即使表現(xiàn)癥狀，也需要同豬痢疾短螺旋體、沙門菌和豬圓環(huán)2型感染之間做出鑒別[5]。組織化學(xué)、免疫熒光和免疫組織化學(xué)等方法可以確認(rèn)組織中是否存在菌體抗原，但只能應(yīng)用于動(dòng)物死后剖檢[5]。目前，國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于活體檢測L.intracellularis的方法包括ELISA及糞便PCR，特異性血清抗體通常在感染2周后可以檢出。但對ELISA結(jié)果的解讀更為復(fù)雜，母源抗體的干擾、活疫苗的使用和康復(fù)后長時(shí)間的抗體存在，使抗體陽性率遠(yuǎn)高于當(dāng)前豬群實(shí)際的感染率。對PPE的病例復(fù)制結(jié)果表明，受感染的豬在1周后即可在糞便中檢出病原菌，具有活性病灶的感染豬在感染后數(shù)周都能排出病菌[6-7]，因而可以通過糞便PCR的方式對PPE做出臨床確診和早期診斷。

熒光定量PCR較常規(guī)PCR靈敏度更高，且全程采用封閉式反應(yīng)，無需核酸電泳等后續(xù)驗(yàn)證，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，推進(jìn)了早期診斷的時(shí)間。本研究針對L.intracellularis的多個(gè)閱讀框，設(shè)計(jì)特異性引物和探針組合。首先通過染料法熒光定量PCR驗(yàn)證上、下游引物的特異性，篩選出靈敏度最高的引物合成相應(yīng)的探針，建立了基于TaqMan 探針的L.intracellularis熒光定量PCR方法，本方法特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性好。將其應(yīng)用于檢測江西地區(qū)部分豬場的糞便樣品，為PPE的臨床防控和地區(qū)流行情況調(diào)查提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及陰性核酸L.intracellularis活疫苗購自德國勃林格殷格翰(上海)動(dòng)物保健品有限公司；經(jīng)商品化熒光定量PCR試劑盒VetMAXTML.intracellularisKit檢測提取自糞便及腸道組織的L.intracellularis陰性核酸，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器糞便DNA提取試劑盒Stool DNA Kit D4015購自O(shè)mega Bio-Tek公司；染料法熒光定量PCR預(yù)混液ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix和探針法熒光定量PCR預(yù)混液AceQ?Universal U+Probe Master Mix V2均自南京諾唯贊生物科技有限公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒(DP104)購自天根生化科技(北京)有限公司；ABI7500型熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)L.intracellularisPHE/MN1-00(AM180252.1)基因組序列，使用Primer 3.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)50對引物和TaqMan探針組合。使用NCBI的Primer BLAST在線軟件進(jìn)行引物的特異性和保守性比較分析，上、下游引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 特異性引物的篩選分別以LI陽性活疫苗核酸、LI陰性核酸和ddH2O作為模板，應(yīng)用SYBR Green Ⅰ染料法熒光定量PCR做上、下游引物的篩選，通過分析比較擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，選擇特異性引物對，對應(yīng)的探針由金斯瑞生物科技有限公司合成，并以FAM標(biāo)記探針5′端，TAMRA標(biāo)記探針3′端，引物及探針見表1。

表1 篩選出用于檢測的引物與探針信息

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒根據(jù)1.4中的篩選結(jié)果，參考LI PHE/MN1-00(AM180252.1)的基因序列，擴(kuò)增靶標(biāo)段基因由金斯生物科技有限公司合成，質(zhì)粒命名為pUC57-LI0662。將收到的含標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的甘油菌進(jìn)行復(fù)蘇，按高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。用Nanodrop 2000測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式計(jì)算拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(拷貝/μL)=6.02×1023拷貝/mol×標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/L)×10-9/標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒相對分子質(zhì)量。

1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化使用1.4中篩選的引物及探針，參考AceQ?Universal U+Probe Master Mix V2推薦的20 μL體系，將提取的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10-7稀釋后作為條件優(yōu)化使用的模板，分別對引物及探針濃度(0.2～30 μmol/L)進(jìn)行優(yōu)化；反應(yīng)程序：37℃ 2 min，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以優(yōu)化后的反應(yīng)體系，再針對引物的理論溫度值進(jìn)行上下各2℃的退火溫度(58，60，62℃)優(yōu)化。

1.7 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將pUC57-LI0662C標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒從起始濃度為2.95×107拷貝 /μL，依次10倍比梯度稀釋至2.95×101拷貝 /μL ，作為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)模板。用優(yōu)化的PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 敏感性試驗(yàn)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度，依次稀釋18個(gè)濃度梯度至理論拷貝數(shù)為1 拷貝/μL，對各梯度樣品做3次重復(fù)，以樣品重復(fù)檢出結(jié)果一致的最低濃度為本方法的檢測靈敏度。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)包括組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)。在組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中，對稀釋的濃度為2.95×106～2.95×102拷貝 /μL 的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板，各進(jìn)行3次重復(fù)，分析產(chǎn)生的Ct值結(jié)果并分別計(jì)算出CV來驗(yàn)證檢測體系的可重復(fù)性。

1.10 臨床樣品的檢測同時(shí)采用普通PCR[11]和本研究建立的L.intracellularisTaqMan熒光定量檢測方法對373份臨床樣品進(jìn)行檢測，比較兩者的檢出率。樣品為采集自江西地區(qū)各地市，共計(jì)9個(gè)豬場的無臨床表現(xiàn)的豬只的新鮮糞便，該9豬場均未使用豬回腸炎疫苗。根據(jù)糞樣的干濕程度使用滅菌PBS對糞樣進(jìn)行稀釋處理，4℃ 3 000 r/min離心5 min，收集上層懸液，按糞便DNA提取試劑盒說明提取核酸。

2 結(jié)果

2.1 特異性引物篩選結(jié)果分析比較不同引物擴(kuò)增L.intracellularis陽性疫苗核酸和L.intracellularis陰性糞便及腸組織核酸及ddH2O對照的熔解曲線，結(jié)果表明，使用相同軟件參數(shù)及經(jīng)過NCBI Primer BLAST驗(yàn)證的引物，在實(shí)際應(yīng)用中存在較大差異，其中擴(kuò)增得目的峰(37/50)、含疑似引物二聚體峰(42/50)和含非特異性峰(14/50)。選擇在擴(kuò)增中只含目的峰，且Ct值最低的引物對(圖1)，合成相應(yīng)的探針。

圖1 引物L(fēng)I-0662qPCR-F1/R1擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線

2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果引物及探針濃度的優(yōu)化結(jié)果顯示，本方法的最佳反應(yīng)體系為：2×AceQ?Universal U+Probe Master Mix V2 10 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.4 μL，探針(8 μmol/L)0.2 μL，模板2 μL和ddH2O 7 μL，總體積20 μL。退火溫度(表4)在60℃時(shí)條件最優(yōu)，最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火，延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒倍比稀釋成2.95×107～2.95×101拷貝/μL 的7個(gè)濃度梯度，以ddH2O為陰性對照，進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得了標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程：y=-3.408 5x+39.671(x：log拷貝數(shù)，y：Ct值)。結(jié)果如圖2所示，方程斜率為-3.408 5，截距為39.671，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 1，擴(kuò)增效率為 96.51%。表明本研究所建立的TaqMan熒光定量PCR方法有理想的擴(kuò)增效率，在該區(qū)間Ct值與拷貝數(shù)間存在良好的線性關(guān)系，可以用于定量分析。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒擴(kuò)增曲線及線性方程

2.4 敏感性試驗(yàn)稀釋多個(gè)低拷貝數(shù)濃度梯度的樣品用于敏感性檢測，結(jié)果見表2，表明所建立的方法檢測病毒的最低濃度為5 拷貝/μL，靈敏度較高。

表2 Taq Man 熒光定量 PCR 的敏感性試驗(yàn)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)以不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析結(jié)果(表3)。本研究所建立的方法，組間CV均小于1%，組內(nèi)CV均小于2%，表明本方法具有較好的重復(fù)性，可以進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測。

表3 組內(nèi)及組間重復(fù)試驗(yàn)

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果共檢測豬群9個(gè)(表4)，對比普通PCR和熒光定量PCR檢出陽性豬場率分別為77.8%(7/9)和88.9%(8/9)；檢測糞便樣品373份，陽性率分別為21.4%(80/373)和27.6%(103/373)。江西省9個(gè)豬群L.intracellularis陽性檢出率區(qū)間分別為0%～32%和0%～40%。通過對江西不同地區(qū)9個(gè)豬群在個(gè)體水平上的PPE感染情況進(jìn)行分析，9個(gè)豬場PPE感染情況差異很大。

表4 江西地區(qū)9個(gè)豬場L.intracellularis檢出率

將檢測的樣品來源按照豬的生產(chǎn)階段分為5類：保育豬、育肥豬、后備豬、經(jīng)產(chǎn)母豬，結(jié)果見表5。

表5 不同階段豬L.intracellularis檢出率

3 討論

了解PPE的致病過程和宿主的免疫應(yīng)答機(jī)制有助于建立特異性的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，OBRADOVIC等[8]綜述了當(dāng)前豬對于L.intracellularis感染的免疫應(yīng)答的研究現(xiàn)狀，展望了其在診斷上的潛在應(yīng)用。當(dāng)前常用于PPE臨床檢測的方法包括ELISA和PCR方法[9-10]。在體液免疫應(yīng)答方面，特異性的IgG和IgM在感染后2周可以檢出，抗體水平在3～4周達(dá)到峰值，并持續(xù)存在達(dá)13周。自然感染豬的血清、腸黏膜、糞便和口腔液中均含有中和抗體，可開發(fā)多種檢測應(yīng)用場景，但自然感染和疫苗免疫產(chǎn)生的抗體是一致的，目前無法做出鑒別[5]。

試驗(yàn)豬在口服感染1周后可在糞便中檢測到病原菌的排出，并可能在長達(dá)10周的時(shí)間內(nèi)間歇性地排菌。因而將糞便樣品、直腸拭子或腸道樣品應(yīng)用分子生物學(xué)方法診斷，可以特異性、快速地檢測樣品中是否存在L.intracellularis核酸，從而實(shí)現(xiàn)確診[5]。常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(real-time RPA)等方法被用于L.intracellularis的檢測[5,11-14]。

豬腸道微生物環(huán)境復(fù)雜，以糞便核酸為檢測對象需要有高效的核酸提取方法和強(qiáng)特異性、高靈敏度的PCR方法。當(dāng)前常用于PCR檢測的靶標(biāo)基因?yàn)?6S rDNA、aspA和dnaA等，由于不同地區(qū)和物種來源的菌株在基因組核酸序列上高度保守性[15]，實(shí)際上可應(yīng)用于PCR擴(kuò)增的靶標(biāo)基因可以有廣泛的選擇。為建立適用于糞便樣品篩查的TaqMan熒光定量檢測方法，本研究針對L.intracellularis基因組中的36個(gè)保守區(qū)共設(shè)計(jì)了50對不同的熒光定量引物。相比于傳統(tǒng)的使用核酸電泳的方法鑒定PCR引物特異性，本研究采用SYBR GreenⅠ染料法的熔解曲線分析進(jìn)行引物的篩選，對擴(kuò)增產(chǎn)物中微量的非特異性產(chǎn)物更敏感，且有效降低高拷貝PCR產(chǎn)物開放操作導(dǎo)致氣溶膠污染的概率。本研究篩選的特異性引物擴(kuò)增的靶標(biāo)基因?yàn)長I0662，該基因在L.intracellularis基因組中為單拷貝存在。經(jīng)敏感性驗(yàn)證，最低檢出限度為5 拷貝/μL，與研究報(bào)道建立的方法為敏感性相近[16-18]，組內(nèi)CV均小于1%，組間CV均小于2%，重復(fù)性良好。

應(yīng)用普通PCR方法與本研究建立的熒光定量PCR方法對采集自江西地區(qū)豬場的373份隨機(jī)糞便樣品進(jìn)行檢測對比，結(jié)果顯示熒光定量PCR敏感性更高，其中檢測場陽性率分別為77.8%(7/9)和88.9%(8/9)，總陽性檢測出率為21.4%(80/373)和27.6%(103/373)，與ARNOLD等[10]對歐洲地區(qū)的流調(diào)結(jié)果，場陽性率90.3%(79.2%～100%)和糞便陽性率26.2%(15.9%～41.5%)接近，說明L.intracellularis在不同地區(qū)廣泛流行。當(dāng)前陰性群體數(shù)量極少，預(yù)示著凈化和根除L.intracellularis非常困難，因此減少群內(nèi)傳播和病原循環(huán)更為重要[19]。DORS等[20]對70個(gè)豬場的9～24周齡育肥豬糞便抽樣檢測，并將豬場規(guī)模和生產(chǎn)方式作為影響因素做生物學(xué)統(tǒng)計(jì)，其育肥群糞便陽性檢出率達(dá)34.7%，相關(guān)性分析顯示全進(jìn)全出式生產(chǎn)影響L.intracellularis的流行，可顯著降低感染率。對本次采樣的糞便樣品按生產(chǎn)階段劃分，結(jié)果顯示經(jīng)產(chǎn)母豬和保育豬群有較高陽性率，分別為28.7%(52/181)和36.4%(28/77)，母豬群體的持續(xù)排菌增加了L.intracellularis場內(nèi)循環(huán)的風(fēng)險(xiǎn)，保育群的感染與仔豬斷奶重、豬場生產(chǎn)方式和環(huán)境條件相關(guān)[19]，基于檢測結(jié)果可調(diào)整合理的生產(chǎn)方式，結(jié)合適時(shí)的藥物保健和疫苗免疫的方式進(jìn)行干預(yù)，以降低感染率提高生產(chǎn)效益。

綜上所述，本研究建立的L.intracellularisTaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測，為疾病確診和指導(dǎo)臨床生產(chǎn)提供依據(jù)。同時(shí)該方法是有效的流行病學(xué)調(diào)查工具，可以用作監(jiān)測地區(qū)PPE的流行。