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    旱半夏組培苗遺傳穩(wěn)定性ISSR分析

    2022-06-16 02:38:38黃勇盛
    南方農(nóng)業(yè) 2022年9期
    關(guān)鍵詞:標(biāo)記技術(shù)培苗條帶

    喻 娜,黃勇盛,黃 旭

    (廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川廣安 638000)

    旱半夏(Pinellia ternata)也稱為半夏、三步跳、麻芋等,天南星科半夏屬多年生草本植物[1]。旱半夏是一種重要的中藥材,塊莖入藥,塊莖的成分75%左右為淀粉,除此之外還含有β-谷甾醇-D-葡萄糖甙、半夏蛋白、鞣質(zhì)、生物堿、多種氨基酸、原兒茶醛及18 種微量元素等藥用成分[2-5]。旱半夏具有鎮(zhèn)咳、祛痰、降壓、健脾胃、止嘔吐、降脂、抗心律失常、抗壞血栓、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗癲癇、減輕動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用,在我國(guó)中醫(yī)藥史上有著廣闊的前景[6-9]。

    已有研究表明,在植物組織培養(yǎng)過程中,體細(xì)胞無(wú)性系在分子水平或染色體水平的變異是普遍存在的一種現(xiàn)象[10]。近年來,簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)(inter simple sequence repeat,ISSR)標(biāo)記技術(shù)常常應(yīng)用于動(dòng)植物的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析,并在遺傳學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用。ISSR技術(shù)已成為DNA分子標(biāo)記技術(shù)中的一個(gè)熱點(diǎn),由Zietkeiwitcz 等[11]于1994年提出,它是在簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的1 種新型分子標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了SSR 和RAPD 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、重復(fù)性強(qiáng)、DNA 模板用量少和實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[12-15],已廣泛應(yīng)用于種群間或種群內(nèi)的遺傳多樣性、遺傳差異性、遺傳穩(wěn)定性分析,對(duì)了解種群遺傳變異的大小、時(shí)空分布及其與環(huán)境變化和人類活動(dòng)的關(guān)系,了解藥用植物種群起源、進(jìn)化歷程和現(xiàn)今分布格局,以及開展藥用植物種質(zhì)資源育種和采取科學(xué)有效的保護(hù)措施均具有指導(dǎo)意義[16-18]。

    此前,已有將分子標(biāo)記法應(yīng)用到天南星科植物領(lǐng)域的遺傳學(xué)分析中的研究,如鄧瑞寧利用SRAP 技術(shù)對(duì)10種不同葉形荊半夏的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了分析[19],成玉等應(yīng)用AFLP 技術(shù)探討半夏屬五個(gè)種的親緣關(guān)系[20],但對(duì)旱半夏組培苗遺傳穩(wěn)定性的研究還未見報(bào)道,本項(xiàng)目采用ISSR分子標(biāo)記法對(duì)旱半夏組培苗繼代五代苗、八代苗、十一代苗、五十代混合組培苗、六十代混合組培苗進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析,以期進(jìn)一步為旱半夏組培苗推廣種植提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本試驗(yàn)材料采自四川省武勝縣萬(wàn)民村(經(jīng)緯度:106.431 56,30.375 21)野生旱半夏,將野生旱半夏移栽至花盆,帶回實(shí)驗(yàn)室,以野生旱半夏葉片為外植體,經(jīng)組培室誘導(dǎo)愈傷再生并繼代培養(yǎng),將野生植株、繼代五代、繼代八代、繼代十一代、繼代五十代,繼代六十代組培苗作為供試材料。

    1.2 DNA的提取和檢測(cè)

    取旱半夏嫩葉和莖,利用《BioFastSpin 植物基因組DNA提取試劑盒》分別提取總DNA,電泳結(jié)果分析表明,電泳條帶整齊、明亮清晰、無(wú)拖尾現(xiàn)象,無(wú)蛋白污染,提取的旱半夏基因組DNA 質(zhì)量較好,樣本適用于ISSR-PCR 檢測(cè)(見圖1)。將樣品放置在-20 ℃冰箱保存。

    圖1 提取的旱半夏總DNA電泳檢測(cè)

    1.3 PCR擴(kuò)增

    實(shí)驗(yàn)用Biospin 全能型植物基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)買自杭州博日科技有限公司,其他普通化學(xué)試劑則購(gòu)自南寧國(guó)拓生物科技有限公司,采用DL2000 Marker 作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。引物是從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100 條UBC-ISSR 引物中篩選出的6 條(見表1),篩選出來的引物由上海生工(San-gon)合成。在(Easy Cycler)梯度PCR 儀(德國(guó),AnalytikJena)上進(jìn)行PCR 反應(yīng),實(shí)驗(yàn)使用20 μL 體系,10 μL Mix,1 μL 引物,1 μL DNA 模板,8 μL ddH2O,94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;56 ℃復(fù)性45 s;72 ℃延伸90 s;40 個(gè)循環(huán):72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。通過PAGE 電泳及銀染。在5200 Multi(上海天能)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)中記錄擴(kuò)增結(jié)果。

    表1 UBC引物系列

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

    通過人工識(shí)別的方式統(tǒng)計(jì)旱半夏不同代數(shù)的凝膠電泳圖譜條帶數(shù)目。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

    圖2 是利用篩選出來的6 條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五代、第八代、第十一代組培苗進(jìn)行ISSRPCR 擴(kuò)增的圖譜,野生型紙質(zhì)同組培苗的帶型和亮度基本一致,第46條引物擴(kuò)增出來的條帶中,組培苗出現(xiàn)了一條多態(tài)性條帶,組培苗第五代、第八代和第十一代的帶型和亮度完全一致,組培苗之間保持了一致(圖2-A、圖2-B)。ISSR 分子標(biāo)記的分析結(jié)果表明,繼代到第十一代的旱半夏組培苗與野生型旱半夏苗基本沒有差異。

    圖2 引物18、25、26、46、55、62在野生植株、第五代、第八代、第十一代組培苗ISSR-PCR擴(kuò)增的條帶

    圖3 是利用篩選出來的6 條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五十代、第六十代組培苗ISSR-PCR 擴(kuò)增的電泳圖譜。從圖譜中看,在旱半夏繼代的過程中,6條引物擴(kuò)增出來的電泳圖譜基本和野生苗的帶型保持一致,沒有發(fā)生明顯變化。其中25 號(hào)引物和46 號(hào)引物擴(kuò)增的第五十代和第六十代組培苗分別出現(xiàn)了一條特異性條帶,第五十代和第六十代組培苗之間完全保持一致(見圖3),因此可以認(rèn)為旱半夏在六十代的繼代過程中具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

    圖3 引物18、25、26、46、55、62在野生植株、第五十代、第六十代組培苗ISSR-PCR擴(kuò)增的條帶

    2.2 旱半夏野生植株與不同組培苗之間的遺傳差異性分析

    篩選的6 條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五代、第八代、第十一代的組培苗進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增,總共擴(kuò)增出110 條條帶,組培苗在擴(kuò)增的幾代過程中電泳條帶帶型基本一致,其中46號(hào)引物擴(kuò)增的條帶中發(fā)現(xiàn),從組培苗第五代出現(xiàn)了一條多態(tài)性條帶,多態(tài)性比例僅僅只有0.88%(見表2)。

    篩選的6條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五十代、第六十代的組培苗ISSR-PCR擴(kuò)增,總共擴(kuò)增出116條多態(tài)性條帶,其中25 號(hào)引物和46 號(hào)引物擴(kuò)增的第五十代和第六十代組培苗分別出現(xiàn)了一條特異性條帶,多態(tài)性比例為1.42%(見表3)。

    表3 野生植株與第五十代、第六十代組培苗遺傳差異性

    3 討論

    對(duì)于藥用價(jià)值極高的旱半夏,采用組培技術(shù)進(jìn)行快繁和生產(chǎn),關(guān)鍵是保持其性狀。旱半夏組培苗一般通過外植體葉片或者莖誘導(dǎo)愈傷組織,然后再?gòu)挠鷤M織分化出再生植株,整個(gè)培養(yǎng)和繼代的過程長(zhǎng)期使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,使生長(zhǎng)點(diǎn)分生組織長(zhǎng)期處于活躍的狀態(tài),可能引起變異。

    對(duì)品種遺傳變異檢測(cè)傳統(tǒng)的方法主要是通過植物形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定和分析,但由于植株的很多基因水平的變異不一定表現(xiàn)出性狀,因此僅僅依靠形態(tài)學(xué)觀察很難準(zhǔn)確的檢測(cè)。而采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單,可以從基因組DNA 的多態(tài)性信息分析,并直接從DNA 水平反映堿基序列片段的變化,因此,可以從分子水平上闡明組培苗遺傳穩(wěn)定性的分子機(jī)理。

    本研究應(yīng)用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)旱半夏組培苗第五代、第八代、第十一代進(jìn)行DNA 檢測(cè),以及對(duì)在實(shí)驗(yàn)室繼代了3 年的第五十代、第六十代苗分別混合批量進(jìn)行ISSR 分析,得到的DNA 片段帶型基本一致,擴(kuò)繁到六十代多態(tài)性僅僅在1.42%,證明組培苗在DNA 水平上基本保持了遺傳穩(wěn)定性。這與前人關(guān)于草莓[21]、桉樹[17]、葉藝春蘭[22]等植物組培苗遺傳穩(wěn)定性的研究報(bào)道一致。由此可見,將組培技術(shù)用于中藥材植物旱半夏的快速繁殖是可行的。

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