百蕊草LRR-RLKs基因的鑒定與生物信息學分析

張文香，常子麗，李 芳，楊香香，丁 波，曹劍鋒*

（1.貴州師范學院生物科學學院藥用植物技術研究所，貴州貴陽 550018；2.衡水學院生命科學學院，河北衡水 053000）

植物中的受體主要有雙元系統(tǒng)、受體激酶兩種，廣泛參與植物的生長、發(fā)育、脅迫、免疫等過程。受體激酶具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內區(qū)三部分，根據胞外區(qū)結構的不同又可分為三種類型：含S 結構域的、富亮氨酸重復的、類表皮生長因子的[1]。其中，富亮氨酸重復的類受體蛋白激酶最多，此類受體的胞外區(qū)域一般具有多個富亮氨酸重復序列，具有與配體結合的功能。目前已在多種植物如擬南芥、玉米、水稻、橘類、大豆、薔薇科中鑒定出編碼此類受體的基因，最早是在玉米中鑒定出來的[2]。

百蕊草(Thesium chinenseTurcz) 是檀香科(Santalaceae)多年生半寄生草本植物，具有清熱解毒、解暑的功效，在我國有著悠久的被用于疾病治療的歷史。百蕊草具有較強的抗菌消炎作用，通常用于治療炎癥相關疾病，是優(yōu)秀的廣譜抗菌中藥材，被譽為“天然抗生素”。對百蕊草粗提物和純化成分的藥理作用和臨床應用研究證實，百蕊草具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制腫瘤細胞增殖等多種藥理作用[3-5]。百蕊草的植物化學成分研究表明，百蕊草中含有黃酮類、生物堿、多糖等成分，其中黃酮類是其重要的指標性成分，在植物的生長、發(fā)育、繁殖和防御中起著多種生理作用。目前對于百蕊草的研究主要在栽培、代謝產物分離與提純等方面，在分子水平對其生長調控機理的研究還較少。本研究根據噴施硝酸銀(1 mmol·L-1)處理及對照轉錄組表達數據，篩選出了被硝酸銀誘導高調表達的富亮氨酸類受體蛋白激酶基因，對其結構與功能進行分析，旨在為從分子水平研究百蕊草的次級代謝和抗逆性提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

百蕊草樣品采自于貴陽市烏當區(qū)東風鎮(zhèn)試驗基地(106°81′E,26°64′N)，挑選野外自然生長處于初果期，長勢、大小和生理狀態(tài)基本一致的百蕊草植株作為實驗植株，采取根、莖、葉組織，迅速凍于液氮。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因的鑒定和克隆

根據本實驗室百蕊草轉錄組數據[6]拼接序列獲得6 878 bp 的序列，通過ORFFinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析工具，預測完整的開放閱讀框（Open Reading Frame），并進行blastp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）在線搜索比對，初步確定基因類型。對通過在線預測得知的兩個較長的ORF（Open Reading Frame），分別為1 278 bp（ORF1）和2 115 bp（ORF2）進行克隆，利用Primer Premier 5 軟件設計特異引物，ORF1 上游引物為ORF1-F：5′-ATGAACAAACCCTACGTTATAG GTC-3′，下游引物為ORF1-R：5′-TCAAATACCTGA CAGGTGGTTATCA-3′ ；ORF2 上游引物為：5′-ATGCTCACCATGCTTGACATGCCTGC-3′，下游引物為：5′-CTACTCTCTTCCCGTGTCCTTGATAA-3′。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以反轉錄合成的cDNA 第1 鏈為模板進行PCR 擴增，50 μL的PCR 反應體系包含25 μL Premix PrimeSTAR HS(TaKaRa) DNA 聚合酶，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2.5 μL，cDNA 模 板1 μL，ddH2O 補齊至50 μL。PCR 反應程序為:98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，68 ℃延伸60 s，30 個循環(huán)；最后68 ℃延伸6 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠純化回收?；厥债a物連接至pMD18-T 載體，采用熱激法轉化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆并測序。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成

采用生工生物的UNlQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒（B511321）提取百蕊草總RNA，采用Thermo Scientific的反轉錄試劑盒（EP0743）進行反轉錄。

1.2.3 生物信息學分析

在HMMER 網站https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan 進行結構域預測；選擇http://web.expasy.org/網址中的ProtParam 工具進行理化性質分析，包括分子量、等電點、親水性、穩(wěn)定性等。在http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html 網站進行信號肽、跨膜結構的預測，在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/網站進行磷酸化位點預測分析。

1.2.4 進化樹分析

以模式植物擬南芥LRR-RLK基因，以及TcLRR1和TcLRR2 的蛋白質全長序列構建進化樹，擬南芥LRR-RLK 蛋白序列及構建方法與參數選擇參考Wang等[7]。

1.2.5 熒光定量PCR

以初果期百蕊草的根、莖、葉cDNA 為模板，以18SRNA 為內參基因，選用ABI 的熒光定量PCR 試劑盒（B639273），在StepOne Plus 型熒光定量PCR 儀（ABI,Foster,CA,USA）上進行擴增。

內參基因引物序列為：

目的基因引物序列為：

反應體系為：上下游引物（10 μM）各0.4 μL，模 板cDNA 2 μL，酶（SybrGreen qPCR Master Mix）10 μL，最后加ddH2O到20 μL。擴增45個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 基因鑒定與分析

根據轉錄組數據拼接得到6 878 bp 的序列，通過在線預測得知有兩個較長的ORF（Open Reading Frame），設計PCR 引物進行克隆驗證，經過測序，確定兩條序列分別為1 278 bp（ORF1）和2 115 bp（ORF2）（見圖1），分別編碼425 和704 個氨基酸（見圖2）。將翻譯得到的蛋白序列在線進行blast 比對，發(fā)現ORF1 的蛋白序列與擬南芥富亮氨酸類受體蛋白激酶EFR（At5g20480）、GSO1（At4g20140）、At3g47570 一致性較高（見圖3a）；ORF2 的蛋白序列與水稻的類受體蛋白激酶Xa21 及擬南芥At3g47570、EFR（At5g20480）一致性較高（見圖3b）。通過HMMSCAN 在線分析保守結構域，發(fā)現ORF1 蛋白序列分別在121aa-181aa、338aa-398aa 位具有一個亮氨酸富集區(qū)域（Leucine-rich repeat），不具有激酶結構域；而ORF2蛋白序列在248-308aa具有重復亮氨酸區(qū)域，在418-689aa 具有激酶結構域（protein kinase domain）（見圖4）。由于兩個蛋白序列都具有富亮氨酸重復序列，因此將編碼ORF1 的基因命名為TcLRR1，編碼ORF2的基因命名為TcLRR2。

圖1 百蕊草ORF1與ORF2的擴增

圖2 百蕊草ORFs的核酸與蛋白序列

圖3 百蕊草ORF1和ORF2 blast比對結果

圖4 百蕊草ORF1與ORF2結構域模式圖

2.2 TcLRR1/2蛋白的理化性質分析

TcLRR1 的分子量為46 458.17，等電點為5.97，全長425 個氨基酸，其中帶負電荷的氨基酸為26 個，帶正電荷的氨基酸20 個，脂肪系數110.75，平均親水系數0.101，不穩(wěn)定系數26.77，為穩(wěn)定蛋白；TcLRR2的分子量為77 780.84，等電點為6.48，全長704 個氨基酸，其中帶負電荷的氨基酸68個，帶正電荷的氨基酸64 個，脂肪系數103.44，平均親水系數0.064，不穩(wěn)定系數33.48，為穩(wěn)定蛋白。

2.3 結構預測

在線對兩條基因的跨膜結構進行了預測，發(fā)現TcLRR1 序列1～24 位為信號肽序列，沒有跨膜結構，預測其序列為胞外序列；TcLRR2 序列1～28 位為信號肽，357-377aa 為跨膜區(qū)域，378-704aa 位于膜內，29-356aa位于膜外。

2.4 磷酸化位點預測

在線進行磷酸化位點預測，發(fā)現TcLRR1 共具有46個磷酸化位點，其中絲氨酸（S）位點最多，為31個；其次是蘇氨酸（T）位點，為10個；酪氨酸（T）位點5個（見圖5a）。TcLRR2共具有89個磷酸化位點，其中絲氨酸（S）位點最多，為62 個；其次是蘇氨酸（T）位點，為17個；酪氨酸（T）位點10個（見圖5b）。

圖5 百蕊草TcLRR1、TcLRR2磷酸化位點預測

2.5 序列比對與進化樹分析

通過TcLRR1 與TcLRR2 序列比對發(fā)現，二者一致性僅16.09%。將兩者與擬南芥LRR-LRKs構建進化樹，發(fā)現TcLRR1 屬于VI-1 亞組，TcLRR2 屬于XII-1 亞組，TcLRR1 與blast比對的At3g47570、At5g20480 及At4g20140 都未聚在同一亞組（見圖6）；TcLRR2 與At3g47570 和At5g20480（EFR）聚為同一亞組，與blast結果一致。

圖6 百蕊草TcLRR1/2與擬南芥LRR-RLKs基因的進化樹分析

2.6 基因表達模式分析

在非脅迫條件下，以初果期的根、莖、葉為材料，選擇葉片作為對照研究了TcLRR1 和TcLRR2 基因的相對表達模式，發(fā)現TcLRR1 和TcLRR2 在葉片中的表達量最高，在莖和根中的表達量低且兩者差異不明顯（見圖7）。

圖7 百蕊草TcLRR1與TcLRR2的組織表達模式

3 結論與討論

近年來，高通量轉錄組測序已經成為研究基因表達調控的主要手段，廣泛應用于藥用植物新基因的發(fā)現、代謝途徑的確定，以及基因家族鑒定、進化分析等方面。百蕊草是優(yōu)良的抗炎抗菌藥材，其中百蕊草素等黃酮類成分為主要活性成分，前期本課題組通過體外使用非生物誘導因子硝酸銀對百蕊草植株進行誘導后，采用高通量轉錄組測序研究百蕊草黃酮等化合物的次生代謝途徑、關鍵基因的表達調控等，通過高通量轉錄組測序在獲得大量次生代謝相關序列信息的同時也獲得了包括LRR 家族在內的一些基因家族序列信息[6]。根據轉錄組表達數據，調取差異表達的6 878 bp的序列進行分析，獲得兩個具有較長開放閱讀框的序列，blast 比對結果表明二者都屬于LRR-RLKs，分別命名為TcLRR1 和TcLRR2。對結構域與跨膜區(qū)分析發(fā)現，TcLRR1 蛋白缺乏跨膜區(qū)與激酶區(qū)，屬于不完全的LRR-RLKs 蛋白，TcLRR2 具有較長ORF，具有完整的LRR-RLKs 基因的結構。進一步對兩個基因的蛋白結構進行比對，發(fā)現TcLRR1在C端具有很長的缺失，因此推測TcLRR1 可能不具有受體激酶的功能，其在植物體內存在的意義還需進一步驗證。

不同物種LRR基因的核酸序列差異較大，同源性較低，但是LRR 基因編碼的氨基酸序列具有相似的結構和功能[8]。TcLRR2 基因結構較完整，blastp 比對發(fā)現它與水稻Xa21 的一致性最高，而水稻Xa21 基因與水稻的免疫性有關[9]，因此猜測TcLRR2 可能與百蕊草的抗逆性有關。目前通過轉錄組測序并進行PCR 驗證，獲得了兩個LRR基因序列，說明百蕊草與其他植物一樣存在著LRR基因家族[10-11]。植物抗性基因作為防衛(wèi)系統(tǒng)的一員，在沒有外界脅迫影響時表達量很低，當有激發(fā)子或誘導子誘導時，抗性基因能高表達，植物能夠識別并激活抗病信號傳導途徑產生防衛(wèi)反應?？剐曰蛟诓煌M織的表達也有差異性[12]，本研究通過熒光定量的方法對這兩個基因在根、莖及葉中的表達情況進行分析，發(fā)現TcLRR1 與TcLRR2 表達趨勢一致，都是在葉片中表達量最高，莖和根中的表達量低且差異不明顯，表明該家族基因在百蕊草中可能存在組織特異性表達的特點，推測葉在逆境信號感知中更為敏感和重要。同時，TcLRR1 與TcLRR2 兩者蛋白序列一致性僅為16.09%，對于功能域不完整的TcLRR1來說，其表達的機理與意義還有待進一步驗證。