三葉木通體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生研究

姜治國(guó) 馬 鑫 胡 勝 李友志 楊敬元 陳發(fā)菊

（1.神農(nóng)架國(guó)家公園管理局，神農(nóng)架金絲猴保育生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 神農(nóng)架 442421；2.三峽大學(xué)，三峽地區(qū)珍稀植物遺傳發(fā)育與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002）

三葉木通（Akebia trifoliate）為木通科（Lardizabalaceae）木通屬半落葉木質(zhì)藤本果樹，木通科植物多為寡種屬或單種屬，其中木通屬有4 種，三葉木通是該屬中唯一的小葉為3 的進(jìn)化支系[1?2]。三葉木通全株可入藥，根及藤莖入藥具有補(bǔ)虛、止咳、清熱利尿、通經(jīng)活絡(luò)、鎮(zhèn)痛、排膿、通乳等功效[3]；其果實(shí)入藥能疏肝理氣、活血止痛、調(diào)息通脈。同時(shí)三葉木通全株蛋白質(zhì)、黃酮類、油脂、氨基酸、多糖、酚類、維生素、礦質(zhì)元素、甾類含量豐富，具有抗氧化功能，能夠提高人體抗病能力、延緩衰老、抗炎防癌[4?5]。除鮮食外，其果實(shí)深加工，可釀制出酒、果汁、果脯、果凍和茶等食品[6]。三葉木通集藥用、食用、經(jīng)濟(jì)、觀賞等價(jià)值于一體，且具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，應(yīng)用前景廣闊[7?8]。但由于三葉木通自然狀態(tài)下結(jié)實(shí)率及發(fā)芽率偏低導(dǎo)致生產(chǎn)用三葉木通資源供不應(yīng)求，因此，快速有效擴(kuò)繁三葉木通，顯得十分必要。

體細(xì)胞胚具有遺傳特性相對(duì)穩(wěn)定、數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)[9]，是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，同時(shí)也是制備人工種子、原生質(zhì)體的基礎(chǔ)，體胚可長(zhǎng)期保存，利于種質(zhì)資源的保存。間接體胚發(fā)生過程的無性系變異利于突變體的選擇，該途徑繁殖效率高，一塊愈傷組織可以產(chǎn)生幾十個(gè)成熟的體細(xì)胞胚，取材范圍也更廣泛[10]。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，影響因素眾多，基因型和外植體類型是影響植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的重要內(nèi)部因素，不同的基因型和外植體類型，在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的難易程度及頻率上會(huì)有差別[11?14]。木本植物的體胚發(fā)生常選取種子和未成熟合子胚作為材料，因?yàn)檫@類細(xì)胞全能性高，分化程度低，脫分化相較于其他組織容易[15]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度及配比對(duì)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)、分化都會(huì)產(chǎn)生重要的影響，是細(xì)胞狀態(tài)和質(zhì)量的重要調(diào)控因素[16]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，有時(shí)單一使用，也可組合使用，作用效果因材料不同而有所差異。常見的組合有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，二者配比不同，誘導(dǎo)作用不同[17?19]。

我國(guó)對(duì)木通屬植物的研究主要集中在藥用成分提取[20?22]方面，組織培養(yǎng)的研究起步較晚。吳玲利[23]對(duì)木通屬白木通（A.trifoliatevar.australis）進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，以白木通的帶芽莖段培養(yǎng)分別得出，腋芽誘導(dǎo)、增殖的最適宜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，同時(shí)得到再生植株；以白木通種胚為試材進(jìn)行沙藏萌發(fā)，得出種胚成苗最適培養(yǎng)條件，建立了組織培養(yǎng)再生體系。近年來，木通屬植物尤其是藥用三葉木通供不應(yīng)求，隨著野生資源的不斷消耗，三葉木通組織培養(yǎng)[24]、多倍體誘變育種[25]、苗木繁殖[26]等人工繁殖的研究逐漸增多，豐富了三葉木通資源的開發(fā)利用途徑。蘇慧慧等[27]用三葉木通試管苗的下胚軸為材料，研究發(fā)現(xiàn)下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)分化與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、不同抗褐化劑及光照時(shí)間等因素都有關(guān)系，其中在培養(yǎng)基中同時(shí)加入適宜濃度的 2,4?D和 NAA 時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá) 96.5 %。有研究表明[28]，以三葉木通未成熟合子胚為材料在不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，誘導(dǎo)率為52.5 %，體細(xì)胞胚數(shù)平均達(dá)19.5個(gè)，且在原生胚胎上以較高頻率（95.8 %）出現(xiàn)次生胚胎，在1/2 MS 中添加0.5 mg/L 6?BA 可顯著提高體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)化為植株的概率，這一研究建立了三葉木通體胚直接發(fā)生體系，而間接發(fā)生體系還未見報(bào)道。賈明良等[29]以三葉木通幼嫩枝條為外植體，得出愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.4 mg/L+2,4?D 4 mg/L+活性炭1 g/L，誘導(dǎo)率為92 %，愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.4 mg/L+6?BA 2.0 mg/L，最高誘導(dǎo)率為15.33 %，然后接種至無激素的MS 培養(yǎng)基中，可得到種苗，但未見生根。由于木通科植物生長(zhǎng)區(qū)域限制，國(guó)外對(duì)于木通科木通屬植物再生培養(yǎng)鮮少報(bào)道。我國(guó)對(duì)三葉木通組織培養(yǎng)方面的報(bào)道從2006 年后逐漸增多，但缺乏體胚發(fā)生及再生培養(yǎng)方面的報(bào)道，并未有建立高效率的體胚發(fā)生體系。本試驗(yàn)以期通過間接方式建立三葉木通體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系，為建立三葉木通的遺傳改良體系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自神農(nóng)架林區(qū)官門山木魚山莊處野生三葉木通，果實(shí)每年8—9 月成熟開裂，于2019 年8 月中旬摘取成熟果實(shí)，此時(shí)種胚（合子胚）未完全成熟。采摘當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室，扒開果實(shí)挑出種子，搓洗干凈放置在4 ℃冰箱中備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

MS 鹽M519?50L（湖北澤川科技有限公司），2,4?二氯苯氧乙酸（2,4?D），α-萘乙酸（NAA），6?芐基嘌呤（6?BA），激動(dòng)素（KT），活性炭（AC），植物組培抗菌劑（PPM），蔗糖，瓊脂等。

高壓蒸汽滅菌鍋HVE?50 日本HRAY AMA制造公司，超凈工作臺(tái)SW?CJ?2E（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），電子分析天平BSA323S（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），pH 計(jì)PHS25 型/3C型（上海越平科學(xué)儀器制造有限公司），50、100、500、1 000 mL 容量瓶，100、200、1 000、5 000 μL移液槍，90 mm 培養(yǎng)皿，鑷子，手術(shù)刀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

以MS 為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（2,4?D、6?BA、NAA、KT 等），蔗糖30 g/L，pH 調(diào)至5.8，瓊脂7 g/L，分裝至培養(yǎng)皿/瓶中，放入高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃，0.1 Mpa 條件下滅菌20 min，待其冷卻凝固后備用。

1.2.2 外植體滅菌

將三葉木通種子用洗潔精水沒過浸泡 5 min，在流水下沖洗 20 min，晾干后裝入錐形瓶轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)進(jìn)行滅菌，倒入75 %乙醇搖晃洗滌30 s，無菌水清洗 2 次，再用0.1 % HgCl2（升汞）溶液進(jìn)行滅菌處理，處理時(shí)間梯度設(shè)置為10、12、15、18、20 min，無菌水清洗6 次以洗凈升汞殘留，最后置于無菌瓶中待用。隨后無菌外植體接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，待15 d 后記錄污染、褐化等生長(zhǎng)情況?？紤]到外植體污染情況，另外在培養(yǎng)基中0.05 % 的PPM，可有效抑制組織培養(yǎng)過程中的微生物污染及內(nèi)源性污染[30]，而不影響外植體誘導(dǎo)愈傷組織。PPM 只在初次誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中使用，后面的試驗(yàn)過程中均不添加。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)及誘導(dǎo)率測(cè)定

用接種刀將滅菌消毒好的種子沿背腹線縱切開，解剖針挑出幼胚，然后接種到MS 添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4?D（1.0、2.0、4.0 mg/L），NAA（0.2、0.5、1.0 mg/L），6?BA（0.2、0.5、1.0 mg/L），KT（0.2、0.5、1.0 mg/L）以及蔗糖 30 g/L、瓊脂7 g/L，pH 為 5.8 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，以不添加植物植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 作對(duì)照。為有效預(yù)防控制外植體污染，在培養(yǎng)基中0.05 % 的PPM，PPM 用于植物組織培養(yǎng)中植物的微生物污染防治與清除。每個(gè)處理接種4 個(gè)培養(yǎng)皿，每皿15個(gè)種胚。放于溫度 (25 ± 2)℃ ，黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.4 體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)及誘導(dǎo)率測(cè)定

待初代愈傷生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，接種至含有不同濃度的NAA（0.1、0.2 mg/L）和6?BA（0.2、0.5、1.0 mg/L）組合的培養(yǎng)基中，置于光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照周期16/8 h，溫度 (25 ± 2)℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，30～40 d 繼代1 次。繼代時(shí)去掉愈傷組織上分化出的不定根及褐化壞死的部分，將體積較大的愈傷切分成大小均勻的愈傷組織塊，切口朝下放置培養(yǎng)基上。培養(yǎng)過程中觀察記錄愈傷組織的生長(zhǎng)變化。

1.2.5 體胚繼代培養(yǎng)

在愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中選取生長(zhǎng)狀況良好的胚性愈傷組織接種到一起，待胚性愈傷組織分化形成體細(xì)胞胚胎后將體胚轉(zhuǎn)移至含有不同濃度的6?BA（0.1、0.2 mg/L）和 NAA（0.05、0.1 mg/L）及不同添加物（香蕉泥、土豆泥、水解酪蛋白）的MS 繼代培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種8 塊體胚，35 ～ 40 d 繼代1 次，觀察并記錄體胚生長(zhǎng)狀況。

1.2.6 植株再生

選取長(zhǎng)勢(shì)良好、有分化趨勢(shì)或已分化的體胚再生苗，轉(zhuǎn)移至MS 培養(yǎng)基中每瓶接種6 塊體胚再生苗，(25 ± 2)℃下光照培養(yǎng)，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度 2 000 lx，觀察并記錄其生長(zhǎng)狀況，待其分化形成完整植株后，在濕度為70 % ～ 80 %的人工光照培養(yǎng)箱中煉苗3～5 d，移栽到滅菌過的泥炭土：蛭石：珍珠巖體積比為 2∶1∶1 的基質(zhì)中進(jìn)一步生長(zhǎng)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2010 和SPSS 23.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌條件對(duì)外植體的影響

三葉木通種子滅菌處理后剝胚接種培養(yǎng)，污染及褐化情況見表1。由表1 可知，升汞滅菌10 min時(shí)，污染率最嚴(yán)重為100 %，隨著滅菌時(shí)間增長(zhǎng)，污染率逐漸降低，而褐化情況則隨之嚴(yán)重，升汞有效殺菌的同時(shí)對(duì)植物外植體的毒害作用較大，因此滅菌時(shí)間不宜過長(zhǎng)。當(dāng)升汞滅菌時(shí)間為18 min 時(shí)，污染及褐化情況較輕，但污染情況雖降低，外植體污染量仍然影響到后續(xù)的愈傷誘導(dǎo)。在培養(yǎng)基中添加低濃度的植物抗菌劑之后有效控制住污染情況。綜合得出，三葉木通種子合適的滅菌處理方式為先用0.1 % HgCl2溶液滅菌18 min，無菌水沖洗干凈后接種在添加了0.05 %PPM 的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，有效控制污染情況，只有極少數(shù)污染現(xiàn)象。

表1 滅菌時(shí)間對(duì)外植體的影響Table 1 Influence of sterilization time on external implants

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)三葉木通幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響

種胚在接種5 d 時(shí)開始啟動(dòng)，10 d 時(shí)如圖1c所示，此時(shí)顏色呈淺黃色，隨后逐漸膨大愈傷化，培養(yǎng)至40 d 時(shí)體積明顯增大，完全形成愈傷組織，如圖1d 所示，顏色呈暗黃色、黃褐色居多。在誘導(dǎo)初代愈傷的培養(yǎng)基中添加0.05 % 的植物組織培養(yǎng)抗菌保護(hù)劑PPM 有效控制了污染率，這在一定程度上提高了誘導(dǎo)出愈傷組織的效率。

圖1 三葉木通幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.1 Callus induced from immature embryos of A.trifoliate

外植體誘導(dǎo)愈傷組織的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2 可知，不同培養(yǎng)基中，愈傷組織的形態(tài)及誘導(dǎo)率有較大差異。外植體在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基中未長(zhǎng)出愈傷組織。在愈傷組織誘導(dǎo)階段，2,4?D 的作用是促進(jìn)外植體脫分化，當(dāng)2,4?D 濃度為1 mg/L 和4 mg/L 時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著，而2,4?D 濃度為2 mg/L 時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率普遍較高。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Influence of different medium on callus induction mg/L

在2,4?D 與6?BA 的組合中，隨著6?BA 濃度的變化，愈傷誘導(dǎo)率未出現(xiàn)規(guī)律性變化，且差異不顯著，愈傷組織狀態(tài)多為黃褐色、深褐色，質(zhì)地疏松；在2,4?D 與NAA 的組合中，愈傷誘導(dǎo)率整體較其他處理高，其中當(dāng)2,4?D 為2 mg/L，NAA 為0.2 mg/L 時(shí)誘導(dǎo)率最高，為95.67 %，這一組愈傷組織多呈現(xiàn)暗黃色、黃褐色，結(jié)構(gòu)較為致密，當(dāng)2,4?D 濃度一定時(shí)，隨著NAA 濃度的升高，愈傷誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著，且含有NAA 的培養(yǎng)基中，愈傷組織表面產(chǎn)生少量不定根；在2,4?D 與KT 的組合中，愈傷誘導(dǎo)率隨2,4?D 濃度的提高呈上升趨勢(shì)，KT 濃度的變化對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響不顯著，愈傷組織的狀態(tài)多為黃褐色、深褐色，質(zhì)地偏硬。由此可知，適宜濃度的2,4?D 和NAA 可促進(jìn)三葉木通幼胚誘導(dǎo)愈傷組織。從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理結(jié)果來看Y14、15、25 與Y13 并未有顯著差異，針對(duì)這一情況持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)Y14、15 愈傷表面產(chǎn)生較多不定根，后期愈傷狀態(tài)沒有Y13 中好，Y25 中出現(xiàn)愈傷褐化死掉的現(xiàn)象，但Y13 中則沒有這一情況。結(jié)合愈傷誘導(dǎo)率和愈傷組織形態(tài)及后續(xù)得生長(zhǎng)狀況來看，MS 添加2,4?D 2 mg/L，NAA 0.2 mg/L 是最適合愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

愈傷組織在繼代培養(yǎng)初期，顏色及狀態(tài)如圖1e和f 所示，大部分呈現(xiàn)褐色、深褐色致密狀態(tài)，去掉2,4?D，放置光照條件下培養(yǎng)繼代1～2 次后部分愈傷組織顏色轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?、黃綠色、綠色此為非胚性愈傷組織，表面呈水漬狀或稀軟不成型如圖2a 所示；胚性愈傷組織多為暗黃褐色、深褐色致密狀態(tài)，如圖2b 所示，可誘導(dǎo)分化形成體細(xì)胞胚，如圖2c 所示。但也有部分胚性愈傷組織未誘導(dǎo)出體胚，逐漸褐化、死掉。

圖2 愈傷組織繼代及體胚誘導(dǎo)Fig.2 Callus subgeneration and somatic embryo induction

NAA 和6?BA 對(duì)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響見表3。由表3 可知，在培養(yǎng)過程中，胚性愈傷組織狀態(tài)維持30d 左右分化形成體細(xì)胞胚胎，低濃度時(shí)體胚誘導(dǎo)率較高。當(dāng)NAA 濃度為0.1 mg/L，6?BA 濃度為0.2 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率最高為55 %，該組處理與其他處理得出的誘導(dǎo)率有顯著性差異。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different media on somatic embryo induction

2.4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、濃度及添加物對(duì)次生胚增殖的影響

繼代過程中體胚遠(yuǎn)離培養(yǎng)基的上端生長(zhǎng)分化，貼近培養(yǎng)基的部分發(fā)生次生胚且不斷增多，處于邊分化邊增殖次生胚的狀態(tài)，多數(shù)體胚形態(tài)正常，有少數(shù)畸形胚，逐漸分化后形態(tài)也是畸形的。但隨繼代次數(shù)增多體胚逐漸分化，次生胚增殖活力變?nèi)?。體細(xì)胞胚胎繼代培養(yǎng)的結(jié)果見表4。由表4 可知，低濃度的NAA、6?BA 添加量有助于次生胚增殖，增殖倍數(shù)隨著6?BA、NAA 濃度的降低有所升高。含外源添加物5 %土豆泥的培養(yǎng)基中次生胚增殖倍數(shù)略高于添加5 %香蕉泥和添加5 % 水解酪蛋白的處理，但香蕉泥、土豆泥、水解酪蛋白的加入對(duì)三葉木通次生胚增殖有輕微的抑制作用。當(dāng)6?BA 濃度為0.1 mg/L，NAA 濃度為0.05 mg/L 時(shí)，次生胚增殖倍數(shù)最高，為19.84，該組處理與其他處理間存在顯著性差異。

表4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、濃度及添加物對(duì)體胚繼代的影響Table 4 Effects of different hormones,concentrations and additives on somatic embryos subculture

2.5 植株再生

成熟的體胚分化后大部分停留在圖3a 狀態(tài)，成苗率及再生苗生根率較低，已生根的再生苗轉(zhuǎn)入MS 中可穩(wěn)定生長(zhǎng)。再生苗株高、葉片明顯長(zhǎng)大，相當(dāng)于起到壯苗作用。待再生苗根長(zhǎng)至3～5 cm左右，放置人工氣候箱中煉苗3～5 d 后轉(zhuǎn)入V（泥炭土）∶V（蛭石）∶V（珍珠巖）為2∶1∶1 的基質(zhì)中，再生植株的形態(tài)正常，并能穩(wěn)定成活。

圖3 體胚分化及植株再生Fig.3 Somatic embryo differentiation and plant regeneration

3 結(jié)論與討論

獲得無菌且具有生長(zhǎng)活性的外植體是組織培養(yǎng)取得成功的重要因素，植物組培常用的滅菌劑是0.1 % HgCl2溶液，能有效殺滅外植體表面的細(xì)菌與真菌，它同時(shí)有較強(qiáng)的毒害作用，使用過度會(huì)造成外植體嚴(yán)重?fù)p傷，需把握滅菌時(shí)間。本試驗(yàn)外植體滅菌后培養(yǎng)污染現(xiàn)象較為嚴(yán)重，尤其是霉菌污染。造成污染的可能因素有培養(yǎng)環(huán)境空氣較為濕潤(rùn)，操作不當(dāng)，在探索出較為合適的升汞滅菌時(shí)間，明顯改善污染率后，污染現(xiàn)象仍存在，污染率依舊較高，分析原因可能是種子內(nèi)部存在內(nèi)生菌。本試驗(yàn)三葉木通種子最佳滅菌處理方式是75 % 乙醇消毒30 s，再用0.1 % HgCl2溶液消毒18 min，培養(yǎng)基中添加0.05 % 的PPM 有效控制了污染率，升汞滅菌時(shí)間的合理把握以及PPM 的添加將污染現(xiàn)象控制在了極少數(shù)范圍內(nèi)，使得誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)污染率非常低。

本試驗(yàn)以三葉木通幼胚為外植體時(shí)誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，繼而誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎間接發(fā)生，且在愈傷組織誘導(dǎo)階段，外植體直接接種在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無法長(zhǎng)出愈傷組織，直接成苗，而Zou 等[28]的研究中以三葉木通未成熟合子胚在不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 則是直接誘導(dǎo)了體細(xì)胞胚胎發(fā)生，這一不同結(jié)果可能是二者所用材料的取樣時(shí)期、材料所處的地點(diǎn)海拔等環(huán)境因素、基因型等造成，外植體生理狀態(tài)不同內(nèi)源激素水平則不同。本試驗(yàn)三葉木通愈傷組織的形成需要植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的刺激誘導(dǎo)。李前[31]研究蒙古櫟（Quercus mongolica）體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)，利用未成熟合子胚誘導(dǎo)愈傷組織得出的最佳培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，不需添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。2,4?D 作為生長(zhǎng)素類似物，有助于促進(jìn)外植體脫分化形成愈傷組織[32]。在本試驗(yàn)2,4?D 對(duì)三葉木通幼胚誘導(dǎo)愈傷組織也是必需因素，當(dāng)濃度適宜時(shí)可得到較高誘導(dǎo)率，濃度過高或過低誘導(dǎo)率都偏低。水稻成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的研究中得出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加2,4?D 濃度為2 mg/L 時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率最高[33]，這與本試驗(yàn)中愈傷組織誘導(dǎo)率最佳時(shí)添加的的2,4?D 濃度一致。6?BA 的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂，芽和愈傷形成。Lei 等[34]在研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)山茱萸（Cornus officinalis）愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響中發(fā)現(xiàn)，低濃度6?BA 有助于形成松散型愈傷組織，本試驗(yàn)添加6?BA 的處理中形成的愈傷組織狀態(tài)較為疏松。2,4?D 和 NAA 組合（2.0 mg/L和0.2 mg/L）對(duì)三葉木通幼胚誘導(dǎo)愈傷組織較好。

在組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例影響著植物器官分化，二者常以組合形式添加影響某一生長(zhǎng)過程。周嬋[35]在優(yōu)化香樟胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖體系的試驗(yàn)中以6?BA 與2,4?D 的不同配比得出分別適宜香樟（Cinnamomum camphora）胚性愈傷誘導(dǎo)、增殖，體胚誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件。本試驗(yàn)愈傷誘導(dǎo)階段，2,4?D 和NAA 的組合與2,4?D 與6?BA 的組合均能得到較高的愈傷誘導(dǎo)率結(jié)果，前者略高于后者，2,4?D 和KT 的組合則明顯低于前兩種組合，當(dāng)2,4?D 濃度一定時(shí)，添加KT 的處理同樣低于添加6?BA、NAA 的處理，三葉木通幼胚誘導(dǎo)愈傷時(shí)，6?BA、NAA 的效果優(yōu)于KT。本試驗(yàn)愈傷誘導(dǎo)最佳組合是2,4?D 2 mg/L，NAA 0.2 mg/L，這與蘇慧慧等[27]研究三葉木通試管苗下胚軸誘導(dǎo)愈傷的最適培養(yǎng)基一致，其愈傷組織誘導(dǎo)率略高于本試驗(yàn)，但未誘導(dǎo)出體胚，且后期愈傷分化并未得到生根幼苗。在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚時(shí)，通常去除2,4?D輔以少量其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[36]，本試驗(yàn)適宜濃度的 6?BA 和NAA（0.2 mg/L 和0.1 mg/L）能夠誘導(dǎo)體胚發(fā)生；低濃度的6?BA 和 NAA（0.1 mg/L 和 0.05 mg/L）可促進(jìn)次生胚增殖；分化的體胚在MS 中可直接再生成完整植株。

外源有機(jī)添加物在組織培養(yǎng)中一直有廣泛應(yīng)用，例如香蕉、土豆、蘋果、椰汁、蛋白胨等，其中含有豐富的氨基酸、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等復(fù)雜成分，可為植物某一生長(zhǎng)過程提供特定的營(yíng)養(yǎng)成分及生理活性物質(zhì)，但具體何種成分如何影響有待進(jìn)一步探索[37]。馬生健等[38]在對(duì)卡特蘭（Cattleya hybrida）組織培養(yǎng)研究中添加椰汁、香蕉泥、馬鈴薯、水解酪蛋白、蘋果汁、椰乳，發(fā)現(xiàn)這6 種有機(jī)添加物對(duì)卡特蘭原球莖增殖均有促進(jìn)作用，其中添加15 %椰乳增殖效率最佳，分化率最低。本研究在體細(xì)胞胚胎繼代培養(yǎng)過程添加香蕉泥、土豆泥、水解酪蛋白這幾種有機(jī)添加物，對(duì)次生胚增殖并未有促進(jìn)作用，在相同條件下添加香蕉泥、土豆泥反而起到一定程度的抑制作用，這可能與其復(fù)雜的成分和含量不穩(wěn)定有關(guān)，說明在三葉木通次生胚生長(zhǎng)增殖培養(yǎng)中不適合添加香蕉泥、土豆泥、水解酪蛋白這幾種添加物。

綜上所述，本試驗(yàn)通過間接方式建立了三葉木通體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系，但體細(xì)胞胚隨繼代次數(shù)增多逐漸分化，次生胚增殖活力也減弱，若能通過外源添加物或其他外在脅迫使體胚一直保持增殖活力或更長(zhǎng)的繼代次數(shù)，將會(huì)增加該體系的效率，另一方面體胚雖能再生出完整植株，但再生率及生根率都較低，因此有待進(jìn)一步優(yōu)化探索。