長吻臭蛙的形態(tài)及生境描述

饒靜秋 魏平凡 楊 云 藍俊麟 劉小龍 袁智勇

（1.西南林業(yè)大學云南省高校極小種群野生動物保育重點實驗室，云南 昆明 650233；2.文山市國家級自然保護區(qū)管護分局，云南 文山 663099；3.云南文山國家級自然保護區(qū)管護局，云南 文山 663099）

長吻臭蛙（Odorrana nasica）隸屬于兩棲綱（Amphibia）無尾目（Anura）蛙科（Ranidae）臭蛙屬，模式產(chǎn)地為越南諒山省母山（海拔范圍915～1 220 m）[1]。根據(jù)Frost 等的研究表明，在越南河靜?。?05°14′38″ E,18°20′53″ N,海拔范圍900～1 200 m）也有該蛙分布[2]。長吻臭蛙是一種小型臭蛙，體背薦椎之后皮膚粗糙，腹面皮膚光滑，吻部極突出，頰部深凹?；铙w背面為棕色或具灰橄欖綠色相間，具一條窄的腺狀背側褶，部分個體具有深色斑；腹面黃白色，具不太明顯的棕色點；吻端及大腿后皮膚為黃色及橄欖綠相間的不規(guī)則斑紋。

目前，該物種在國外分布于泰國西北部和越南北部[3]。盡管該種被認為在中國也有分布[3]，但目前尚未有相關文獻證實。該物種在國內的具體分布地點、形態(tài)特征以及相應的生境均不清楚。本研究在2018 年7 月和2021 年2 月，分別在云南省文山壯族苗族自治州馬關縣及西疇縣采集到3 只臭蛙屬標本，根據(jù)上述主要鑒別特征對比及分子生物學鑒定，確定采集物種為長吻臭蛙。通過對新采集的3 號長吻臭蛙標本進行了相應的形態(tài)特征測量及描述，并對2 個采集地的生境進行了描述，證實該物種在國內的分布記錄，并補充了具體分布情況及相應的生境介紹。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2018 年7 月和2021 年2 月，分別在云南省文山州馬關縣都龍鎮(zhèn)四臺坡（104°33′47″ E,22°55′12″ N,海拔1 417 m）附近采集到雌性臭蛙標本2 號（標本號SWFU 0048,SWFU 0049）；在西疇縣法斗鄉(xiāng)文山國家級自然保護區(qū)小橋溝片區(qū)（104°45′45″ E,23°21′36″ N,海拔1 518 m）采集到雄性標本1 號（SWFU 006976），并收集腳趾樣品3 號（組織號Yuan 10161、Yuan 10162、Yuan 10185）。所采集的標本取出肌肉及腳趾樣品均儲存在95 %乙醇中以用于后續(xù)的分子實驗。整體標本固定保存于75 %乙醇中，并保存于西南林業(yè)大學。

1.2 形態(tài)學測量

依據(jù)文獻[4?5] 的測量方法，用數(shù)顯卡尺對2 個成年雌性及一只雄性標本進行形態(tài)學測量，精確到0.1 mm。測量指標：體長（SVL），自吻端至體后端的長度；頭長（HL），自吻端至上、下頜關節(jié)后緣的長度；頭寬（HW），最大頭部寬度；吻長（SL），自鼻間到眼孔前角的長度；鼻間距（INS），左右鼻孔內緣之間的距離；眼間距（IOS），左、右上眼瞼內側緣之間的最窄距離；眼徑（ED），與體軸平行的眼球外露部分的直徑；上眼瞼寬（UEW），上眼瞼最大寬度；鼓膜徑（TD），鼓膜的水平直徑，測量到鼓膜邊緣的外緣；鼓膜到眼睛距離（TEY），自眼孔的后緣至鼓膜邊緣的前緣；手長（HND），自手掌結節(jié)基部至Ⅲ指指尖；股骨長度（FEM）；脛骨長度（TIB）；跗足長（LFT），從脛骨跗骨關節(jié)到IV 趾趾尖；足長（FL），從跖骨內結節(jié)基部至IV 趾趾尖；第III 指指吸盤的水平直徑（F3DSC）。

1.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究采集了2 號標本的肌肉組織（標本號SWFU 571、SWFU 572）及3 號腳趾樣品（Yuan 10161、Yuan 10162、Yuan 10185），采 用ThermoFisher Scientific 公司所提供的DNA 提取試劑盒的提取方案來提取該物種DNA，然后 ?20 ℃保存?zhèn)溆?。使用引?6SAR（5′?CGC CTG TTT ACC AAA AAC AT?3′）和16SBR（5′?CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T?3′），對其16S rRNA基因進行擴增[6]。聚合酶鏈式反應（PCR）程序為95 ℃預熱10 min，95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，進行35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min；PCR 擴增產(chǎn)物最后送至上海生工生物工程有限公司測序。測序后得到的結果使用DNASTAR Lasergene.v7.1 軟件包中的Seqman程序進行比對[7]。將已比對16S rRNA 序列數(shù)據(jù)上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫 （GenBank 號：OK464876-OK464880）

基于已比對的16S 序列數(shù)據(jù)，本研究采集的臭蛙標本屬于Liu[5]和Chen 等[8]揭示的臭蛙屬7 個進化支（A?G）中F 支系內的物種。因此，從GenBank 下載臭蛙屬該支系的全部7 個物種，共7 條序列，并采用F 支系的最近姐妹支系中的大綠臭蛙（Odorrana graminea,Boulenger 1899）的序列作為外群[8]。本研究同時使用了貝葉斯法（BI）和最大似然法（ML）進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。運用JModelTest 2 選擇最合適的模型構建ML 樹和BI 樹[9?10]，為GTR+G。使用RAxML 8.2.4 版本運行最大似然估計（ML）[11]，在ML 分析下使用非參數(shù)自助重取樣重復1 000 次來評估自引支持度，采用MrBayes 3.2 進行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析[12]。使用4 條馬爾科夫鏈運行2 000萬代，每1 000 代進行1 次抽樣，基于收斂的情況，前25 % 代數(shù)舍棄掉。使用Tracer v 1.5[13]來檢測有效樣本量（ESS200）以檢查各運行參數(shù)值是否收斂，應用MEGA X 計算種內及種間遺傳距離（p?distance）[14]。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)描述

本次采集的2 只雌性長吻臭蛙成體體長分別為75.7 mm 及71.3 mm，雄性長吻臭蛙成體長為49.3 mm，其余各部位量度數(shù)據(jù)見表1。頭部寬度小于頭部長度；吻部較扁平，吻端在背視圖中稍鈍圓，突出于下頜外；鼻部深凹，鼻孔背外側到眼睛及吻端距離相等；吻棱明顯；鼻間距大于眼間距；吻長大于眼徑；鼓膜非常清晰，鼓膜邊緣相對于鼓膜稍高；鼓膜徑明顯小于眼徑；眼間距略小于上眼瞼寬；松果體可見；犁骨齒略呈傾斜，位于內鼻孔之間；內鼻孔呈橢圓形，接近犁骨齒；舌后端缺刻深，呈“U 形”（圖1～3）。

表1 云南馬關縣及西疇縣長吻臭蛙雌性及雄性成體量度Table 1 Measurements of the adult specimens of O.nasica

圖1 長吻臭蛙（云南省西疇縣法斗鄉(xiāng)，雄性）Fig.1 O.nasica (Fadou Town of Xichou County,Yunnan Province,male)

雄性成蛙體背薦椎之后包括背側褶之下的體側面密布圓錐狀刺（圖1），雌性成蛙該區(qū)域布稀疏疣粒（圖2）?；铙w背面為棕色或具灰橄欖綠色相間，部分個體具有深色斑，具一條窄的腺狀背側褶。吻棱及腺狀側褶外邊緣呈黑色；鼻孔下方至上唇白色，鼓膜微紅；四肢具數(shù)條規(guī)則的黑色橫條紋；腹面黃白色，具不太明顯的棕色點；吻端及大腿后皮膚為黃色及橄欖綠相間的不規(guī)則斑紋（圖2～3）。標本浸泡后背部呈棕紅色，體側顏色略深于體背呈棕黑色，腹面呈白色。

圖2 長吻臭蛙（云南省馬關縣都龍鎮(zhèn)，SWFU 0048，雌性）Fig.2 O.nasica (Dulong Town of Maguan County,Yunnan Province,SWFU 0048,female)

圖3 長吻臭蛙手部及足部形態(tài)（云南省馬關縣都龍鎮(zhèn)，SWFU 0048，雌性）Fig.3 Hands and foots of O.nasica (Dulong Town of Maguan County,Yunnan Province,SWFU 0048,female)

長吻臭蛙雌雄差異較大，雄性體型小于雌性，且體長約為雌性體長的70 %；雄性肱腺缺失，具有一對咽側下外聲囊；雄性成體第一指基部粗大，婚墊發(fā)達；體背薦椎之后包括背側褶之下的體側面密布圓錐狀刺。

2.2 生境描述

本研究中所采集的長吻臭蛙樣本序列與已有長吻臭蛙序列[4]聚在同一支系，與安子山臭蛙（Odorrana yentuensis）形成姐妹群關系。種內遺傳距離（p-distance）為1.1 %，與姐妹種間遺傳距離為2.8 %，系統(tǒng)發(fā)育分析的結果顯示采集于馬關縣和西疇縣的臭蛙標本為長吻臭蛙（圖4）。

圖4 基于線粒體16s rRNA 構建臭蛙屬F 支系的貝葉斯樹Fig.4 Bayesian inference tree of Odorrana derived from 16s rRNA sequences

3 結論與討論

本研究在云南文山州采集到的長吻臭蛙標本與該蛙模式產(chǎn)地越南諒山省母山（Mau Son Mountains,Lang Son province,Vietnam）的標本在外部形態(tài)描述上基本一致。馬關縣采集到的長吻臭蛙標本均為雌性，與西疇縣采集到的雄性標本相比雌性體長明顯大于雄性（馬關縣長吻臭蛙雌性體長：71.32～75.7 mm；西疇縣長吻臭蛙雌性體長：49.3 mm），雄性成蛙體長約為雌性的70 %。西疇縣采集到的雄蛙與模式標本記錄的4 只雄性相比體長及形態(tài)特征描述均一致。系統(tǒng)發(fā)育分析的結果顯示，采集于馬關縣和西疇縣的臭蛙標本均為長吻臭蛙?；谝陨辖Y果，本研究證實了長吻臭蛙在中國云南省文山州的分布。

長吻臭蛙的繁殖季節(jié)推測應該在2—4 月。研究人員于2016—2018 年的4、6、8 月在西疇縣監(jiān)測期間均沒有見到該蛙的成體，也沒有聽到該蛙的叫聲。僅于2017 年4 月初監(jiān)測期間發(fā)現(xiàn)有雌性成體（未采集），而在2021 年2 月初考察期間見到大量雄性個體及少量雌性個體，叫聲頗多，但未見到抱對個體或卵團，推測應該是在繁殖早期，后續(xù)更多的考察研究可豐富該物種的生物學資料。

致謝：本研究得到了以下項目支持：云南省基礎研究計劃（專項）優(yōu)秀青年項目（202001 AW070016），云南省中青年學術和技術帶頭人后備人才項目（202005AC160046），中國科協(xié)青年人才托舉工程（2019?2021QNRC001），生態(tài)環(huán)境部生物多樣性調查、觀測和評估項目（2019—2023 年），第二次青藏高原綜合科學考察研究（2019QZKK0501）。感謝西南林業(yè)大學吳東益、賀艷紅和黃佳玥同學在分子實驗及鑒定方面給予的幫助。