白藜蘆醇對(duì)鎘誘導(dǎo)HEK 293T細(xì)胞自噬與凋亡的影響

王蕓蕓，劉小綪，邵巒巒，楊 穎，蔣琦辰，毛偉平

(南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046)

鎘(Cd)是銀白色有金屬光澤不溶于水的有毒重金屬，廣泛用于制造電池、顏料、塑料制品以及電鍍[1-3]。絕大多數(shù)淡水中鎘含量很低，不會(huì)直接影響健康，但由于鎘半衰期比較長(zhǎng)，排出速度緩慢，所以易在生物體中富集，當(dāng)鎘進(jìn)入人體后，主要在肝臟和腎臟中積聚，從而導(dǎo)致各種疾病[4-5]。體內(nèi)外研究表明，鎘進(jìn)入機(jī)體后會(huì)引起機(jī)體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)增多，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激并對(duì)機(jī)體造成損傷[6-8]。

自噬是細(xì)胞保護(hù)自己的一種方式，通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物，形成自噬體回收成分，保護(hù)細(xì)胞免受藥物、饑餓等壓力的影響[9]，研究報(bào)道，鎘可以介導(dǎo)細(xì)胞自噬。Dong等[10]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)或缺乏生長(zhǎng)因子時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，低濃度鎘可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來(lái)保護(hù)細(xì)胞。Lim等[11]將RWI38細(xì)胞暴露于鎘中，發(fā)現(xiàn)低劑量鎘可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并抑制細(xì)胞凋亡。最近也有研究表示，鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有助于抑制大鼠近端腎小管細(xì)胞[12]和肝細(xì)胞[13]自噬。更重要的是，鎘暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和自噬抑制促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。由此可見(jiàn)，不同環(huán)境、不同濃度甚至不同細(xì)胞中，鎘誘導(dǎo)自噬與凋亡情況不盡相同，目前，鎘誘導(dǎo)自噬和凋亡之間的關(guān)系尚不明確，有待進(jìn)一步探索。

白藜蘆醇(Resveratrol, RSV)是一種普遍存在于葡萄、桑椹和虎杖等植物中的多酚類(lèi)化合物[15]。研究表明，RSV以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種方式存在于自然界，具有抗氧化效應(yīng)，對(duì)癌癥、腫瘤、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病都具有一定的預(yù)防和治療作用[16-18]。近年來(lái)有研究顯示，白藜蘆醇可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路[19]，降低葡萄糖吸收和代謝[20]，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡和自噬[21]；此外，研究發(fā)現(xiàn)，低濃度白藜蘆醇在缺氧時(shí)可增加細(xì)胞內(nèi)自噬體形成，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬，減緩細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞[22]。以上結(jié)果提示白藜蘆醇調(diào)控細(xì)胞生存與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬途徑有關(guān)，但具體分子機(jī)制仍有待探究。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鎘誘導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)自噬保護(hù)自身，高濃度鎘導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但尚未明確白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與凋亡之間的關(guān)系。因此，本研究對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行探索，并為白藜蘆醇的生物用藥提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞系

HEK 293T(人腎細(xì)胞)購(gòu)買(mǎi)于ATCC細(xì)胞庫(kù)并由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。用DMEM高糖培養(yǎng)液(10%胎牛血清+100 U/L青霉素+100 U/L鏈霉素)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，以1∶3消化傳代。

1.1.2 試劑與儀器

高糖DMEM(天津Mediatech公司)；胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國(guó)GIBCO公司)；DMSO(美國(guó)Amresco公司)；活性氧檢測(cè)試劑盒、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒、毒胡蘿卜素(TG，可特異性抑制自噬體-溶酶體的融合)(上海Beyotime公司)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ECL發(fā)光液(南京Vazyme公司)；環(huán)氧樹(shù)脂(美國(guó)EMS公司)；EX-527(SIRT1抑制劑)(美國(guó)Selleck Chemicals公司)；兔抗人LC3B多克隆抗體、氯化鎘、3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬抑制劑)、TMEMD(美國(guó)Sigma公司)；羊抗兔IgG-HRP多克隆抗體、β-actin抗體、GAPDH抗體、兔抗人SIRT1多克隆抗體、兔抗人cleaved-caspase-3多克隆抗體(南京Bioworld公司)、兔抗人cathepsin L單克隆抗體、兔抗人LAMP2多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；常規(guī)化學(xué)試劑均產(chǎn)自南京化學(xué)試劑廠。熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、TE2000-U倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；HT7800透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬

將HEK 293T細(xì)胞以1×105/孔密度接種于六孔板中適應(yīng)性培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組處理24 h，收集細(xì)胞。用預(yù)冷1×PBS洗滌3次，5%戊二醛4 ℃固定3 h，離心，吸出上清液，將樣品放入60 ℃ 水浴鍋中，加20 μL瓊脂，攪拌均勻后取出冷凝。將冷凝為瓊脂塊的方塊轉(zhuǎn)移到玻璃瓶?jī)?nèi)，用PBS每隔15 min洗滌1次，共3次。鋨酸固定，然后用梯度濃度丙酮各脫水1次，每次15 min，無(wú)水丙酮脫水2次，每次8 min。再分別用丙酮/樹(shù)脂比例為1∶1和1∶2浸透樣品1 h，純樹(shù)脂浸透2 h，包埋，再分別放置在30 ℃，45 ℃和60 ℃各聚合1 d。半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡定位。超薄切片，雙染(醋酸雙氧鈾染色25～30 min，檸檬酸鉛染色6～7 min)，干燥，HT7800顯微鏡觀察并拍照。

1.3 Western blot分析LC3B-Ⅱ/Ⅰ、cathepsin L、SIRT1、caspase-3蛋白表達(dá)

細(xì)胞收集： 吸盡六孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS漂洗細(xì)胞3次，然后將收集到的細(xì)胞按標(biāo)記放入EP管中，加200 μL 預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，超聲波破碎3次，100 ℃煮樣5 min。4 ℃，13 000 r/min離心2 min，棄上清并于-70 ℃ 冰箱保存。SDS-PAGE電泳分析： 取50 μg總蛋白90 V電泳90～120 min。轉(zhuǎn)膜： 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(24 V,2 h)。封閉： 用含5%脫脂奶粉/BSA的PBST將PVDF膜封閉2 h，PBST清洗4次，每次10 min。敷對(duì)應(yīng)一抗，4 ℃過(guò)夜，PBST清洗4次，敷二抗，4 ℃過(guò)夜，暗室曝光ECL顯示結(jié)果。

1.4 激光共聚焦分析GFP-LC3、LAMP2表達(dá)

HEK 293T細(xì)胞在六孔板內(nèi)培養(yǎng)，待長(zhǎng)至60%左右時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前30～60 min吸去原有細(xì)胞培養(yǎng)液，加入新鮮的不含抗生素的完全培養(yǎng)液。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取600 μL CaCl2于無(wú)菌離心管中，再取不多于20 μL pcDNA3.1-GFP-LC3B質(zhì)粒DNA加入到CaCl2溶液中，吹打均勻。將DNA-CaCl2加入到600 μL BBS溶液中(兩者順序不能顛倒)，混勻，室溫孵育10～20 min，平均加到六孔板中，靜置4～16 h，期間輕輕搖晃幾次，去六孔板中含磷酸鈣沉淀的培養(yǎng)液，加2 mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h。PBS漂洗細(xì)胞3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min。吸去多聚甲醛，PBS清洗3次，1%BSA固定30 min。用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞觀察。

1.5 活性氧檢測(cè)

將HEK 293T細(xì)胞以1×105/孔密度接種于六孔板中適應(yīng)性培養(yǎng)，隨機(jī)將細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度Cd2+、RSV和RSV/Cd2+共處理組處理細(xì)胞24 h。用無(wú)血清培養(yǎng)液對(duì)熒光探針DCFH-DA進(jìn)行稀釋(10 μmol/L)，稀釋后取出一定量將細(xì)胞重懸，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min(隔3～5 min顛倒混勻一次)。用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞活性形態(tài)學(xué)觀察

將HEK 293T細(xì)胞以1×105/孔密度接種于六孔板中適應(yīng)性培養(yǎng)，隨機(jī)將細(xì)胞分為對(duì)照組、Cd2+、RSV和Cd2+/RSV共處理組處理細(xì)胞24 h，TE2000-U倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HEK 293T細(xì)胞以1×105/孔密度接種于六孔板中適應(yīng)性培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、RSV、Cd2+和Cd2+/RSV共處理組處理細(xì)胞24 h。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，4 ℃，2 000×g離心5 min，收集細(xì)胞。PBS漂洗細(xì)胞2次，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，5 μL Annexin-V標(biāo)記，混勻，避光染色10 min，再加入10 μL PI染液，吹打混勻，避光染色5 min。補(bǔ)加1×Binding Buffer 350 μL，1 h內(nèi)用BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)來(lái)表示；采用Image J軟件和Oringe分析；對(duì)試驗(yàn)組數(shù)據(jù)的均值比較采用Studentst檢驗(yàn)，確定差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 透射電子顯微鏡觀察鎘誘導(dǎo)HEK 293T細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成

如圖1所示，對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，核膜完整。8 μmol/L CdCl2處理組細(xì)胞其胞核周?chē)忻黠@自噬空泡和自噬溶酶體形成(黑色箭頭表示自噬體，白色箭頭表示自噬溶酶體)。

圖1 HEK 293T細(xì)胞暴露于CdCl2中24 h 后透射電子顯微鏡觀察結(jié)果Fig.1 Electron microscope of HEK 293T cells exposed CdCl2 for 24 hHEK 293T細(xì)胞暴露在8 μmol/L Cd2+中24 h，黑色箭頭表示 自噬體，白色箭頭表示自噬溶酶體.

2.2 白藜蘆醇對(duì)鎘誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響

利用不同濃度CdCl2(0～10 μmol/L)處理及先用40 μmol/L RSV預(yù)處理1 h再用不同濃度CdCl2處理細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量，激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞自噬質(zhì)粒(pcDNA3.1-GFP-LC3B,GFP-LC 3)表達(dá)量，結(jié)果如圖2(a,b)所示。圖2(a) 顯示，只單獨(dú)使用不同濃度CdCl2處理細(xì)胞時(shí)，隨著鎘濃度增加，LC3B-Ⅱ表達(dá)量呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性增加，在8 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，10 μmol/L時(shí)有所下降；RSV共處理后，與鎘單獨(dú)處理組相比，共處理組中LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量進(jìn)一步增加。圖2(b)顯示，與單獨(dú)鎘處理相比，共處理組GFP-LC3表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。隨后我們選用細(xì)胞自噬抑制劑3-MA分別聯(lián)合(0、8、10 μmol/L)Cd2++RSV處理HEK 293T細(xì)胞24 h，結(jié)果如圖2(c)所示，與Cd2+/RSV組相比，3-MA聯(lián)合處理組中LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平均顯著下降。10 μmol/L Cd2++RSV、10 μmol/L Cd2++RSV+3-MA組檢測(cè)結(jié)果如圖2(d)所示，3-MA共處理組GFP-LC3表達(dá)量也下降。以上結(jié)果表明，白藜蘆醇進(jìn)一步增強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，3-MA能減弱這種協(xié)同效應(yīng)。

圖2 Western blot和激光共聚焦檢測(cè)自噬基因LC3B-Ⅱ/Ⅰ和GFP-LC3的表達(dá)水平Fig.2 The expression of autophagy genes LC3B-Ⅱ/Ⅰ and GFP-LC3 detected by Western blot and confocal microscope(a)和(b)： 細(xì)胞使用或不使用RSV(40 μmol/L)處理1 h后，暴露在0～10 μmol/L CdCl2中；(c)和(d)： 3-MA分別與0、8、10 μmol/L Cd2++RSV聯(lián)合處理HEK 293T細(xì)胞24 h.n=3,mean±SEM;*P<0.05,**P<0.01 vs對(duì)照組;#P<0.05,##P<0.01 vs Cd2+/RSV共處理組,Students t-test.

2.3 白藜蘆醇對(duì)溶酶體活性的影響

選用生理鹽水、40 μmol/L RSV、5 mmol/L 3-MA、8 μmol/L和10 μmol/L Cd2++RSV、8 μmol/L和10 μmol/L Cd2++RSV+3-MA分別處理HEK 293T細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)LC3B-Ⅱ/Ⅰ和溶酶體標(biāo)志蛋白cathepsin L表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。圖中顯示，鎘處理能增強(qiáng)細(xì)胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ和cathepsin L表達(dá)，白藜蘆醇加入后進(jìn)一步增強(qiáng)，但3-MA聯(lián)合處理較Cd/RSV共處理相比，LC3B-Ⅱ/Ⅰ和cathepsin L表達(dá)量均降低，表明白藜蘆醇能增強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中溶酶體的活性，且當(dāng)細(xì)胞自噬被抑制時(shí)，溶酶體活性也會(huì)降低。

圖3 Western blot檢測(cè)LC3B-Ⅱ/Ⅰ和cathepsin L的表達(dá)水平Fig.3 The expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰ and cathepsin L detected by Western blot(a) 用RSV(40 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后暴露于8、10 μmol/L Cd2+中；(b) 先用RSV(40 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞，利用3-MA處理或不處理1 h,再暴露于8、10 μmol/L Cd2+中.n=3,mean±SEM;*P<0.05,**P<0.01 vs 對(duì)照組;#P<0.05,##P<0.01 vs Cd2+/RSV共處理組,Students t-test.

2.4 白藜蘆醇與自噬體溶酶體融合之間的關(guān)系

選用生理鹽水、3 μmol/L TG、RSV、8 μmol/L和10 μmol/L Cd2++RSV、8 μmol/L和10 μmol/L Cd2++RSV+TG分別處理HEK 293T細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)cathepsin L、LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)對(duì)照組、10 μmol/L Cd2+、10 μmol/L Cd2++RSV和10 μmol/L Cd2++RSV+TG處理組細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3和溶酶體相關(guān)膜蛋白結(jié)合蛋白2(Lysosomal-Associated Membrane Protein 2, LAMP2)表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示。

圖4(a)顯示，與Cd2+/RSV處理組相比，Cd2+/RSV/TG聯(lián)合處理組中cathepsin L表達(dá)量減少，說(shuō)明溶酶體活性降低，但LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量增多，說(shuō)明細(xì)胞自噬依然顯著增強(qiáng)。圖4(b)顯示，與鎘單獨(dú)處理組相比，加入RSV/TG后GFP-LC3表達(dá)量均表現(xiàn)為增強(qiáng)，表明自噬效應(yīng)是增強(qiáng)的，但LAMP2表達(dá)量卻降低，顯示溶酶體活性降低。

圖4 Western blot與激光共聚焦顯示自噬-溶酶體融合與RSV之間的關(guān)系Fig.4 The relationship between autophagosome-lysosome fusion and RSV detected by western blot and confocal microscope(a) 先用RSV(40 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞，利用TG處理或不處理1 h，再暴露于8或10 μmol/L Cd2+中；(b) 激光共聚焦結(jié)果.紅色代表LAMP2免疫熒光，綠色代表GFP-LC3熒光.n=3,mean±SEM;*P<0.05,**P<0.01 vs 對(duì)照組;#P<0.05,##P<0.01 vs Cd2+/TG共處理組,Students t-test.

2.5 白藜蘆醇能抑制鎘誘導(dǎo)的ROS增加

選用不同濃度CdCl2(0～10 μmol/L)處理及先用40 μmol/L RSV預(yù)處理1 h再用不同濃度CdCl2處理細(xì)胞24 h，檢測(cè)ROS含量，結(jié)果如圖5所示，隨著鎘濃度增加，ROS呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性增加，加入RSV后ROS含量顯著下降。

圖5 白藜蘆醇抑制鎘誘導(dǎo)的ROS增高Fig.5 Resveratrol inhibits the increase of ROS which induced by cadmiumn=3,mean±SEM;*P<0.05,**P<0.01 vs 對(duì)照組;#P<0.05,##P<0.01 vs Cd2+/RSV共處理組,Students t-test.

2.6 白藜蘆醇通過(guò)激活SIRT1調(diào)節(jié)鎘誘導(dǎo)的自噬

選用生理鹽水、10 μmol/L Cd2+、40 μmol/L RSV、1 μmol/L EX-527+RSV、Cd2++RSV、Cd2++RSV+EX-527、1 mmol/L H2O2、RSV+H2O2、RSV+H2O2+EX-527分別處理HEK 293T細(xì)胞24 h，利用Western blot檢測(cè)LC3B-Ⅱ/Ⅰ和沉默信息調(diào)節(jié)子2相關(guān)酶1(Silent Information Regulation 2 Homolog1, SIRT1)表達(dá)，激光共聚焦觀察經(jīng)Cd2+、RSV/Cd2+和EX-527/RSV/Cd2+處理后的細(xì)胞熒光含量，結(jié)果如圖6所示。圖6(a，b)顯示，不管是鎘處理還是H2O2處理，單處理中LC3B-Ⅱ/Ⅰ和SIRT1蛋白表達(dá)量均增加，而EX-527聯(lián)合處理會(huì)抑制這三種蛋白的增強(qiáng)；激光共聚焦實(shí)驗(yàn)也表明，RSV/Cd2+處理組中細(xì)胞內(nèi)自噬體溶酶體融合較多，添加EX-527后，GFP-LC3和LAMP2表達(dá)水平均下降(圖6(c))。

圖6 白藜蘆醇增強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的自噬體溶酶體融合以及STRT1的表達(dá)量變化Fig.6 The relationship between resveratrol enhances autophagy induced by cadmium and STRT1(a) RSV(40 μmol/L)/EX-527(1 μmol/L)/Cd2+(10 μmol/L)共處理細(xì)胞24 h；(b) RSV(40 μmol/L)/EX-527(1 μmol/L)/H2O2(1 mmol/L)共處理細(xì)胞24 h；(c) 激光共聚焦結(jié)果，紅色代表LAMP2免疫熒光，綠色代表GFP-LC3熒光.

2.7 白藜蘆醇對(duì)鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

選用生理鹽水、10 μmol/L Cd2+、20 μmol/L Cd2+、40 μmol/L RSV以及Cd2++RSV分別處理細(xì)胞24 h后，TE2000-U顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot分析caspase-3表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，結(jié)果如圖7(見(jiàn)第58頁(yè))所示。圖7(a)顯示： RSV單獨(dú)處理與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯變化，而鎘處理組中細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮，變圓，高濃度鎘處理時(shí)還出現(xiàn)大量漂浮，經(jīng)RSV共處理后皺縮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說(shuō)明白藜蘆醇能一定程度地削弱鎘誘導(dǎo)的HEK 293T細(xì)胞形態(tài)改變。圖7(b)顯示鎘誘導(dǎo)細(xì)胞中caspase-3表達(dá)量呈濃度依賴(lài)性增加，白藜蘆醇共處理后有所下降。流式細(xì)胞術(shù)也表示，鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象被白藜蘆醇阻滯(圖7(c))。

圖7 白藜蘆醇對(duì)鎘誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of resveratrol on HEK293T cell apoptosis induced by cadmium細(xì)胞使用或不使用 RSV(40 μmol/L)處理1 h后，暴露在10或20 μmol/L CdCl2中.(n=3,mean±SEM;*P<0.05,**P<0.01 vs 對(duì)照組;#P<0.05,##P<0.01 vs Cd2+/RSV共處理組,Students t-test).

3 討 論

鎘作為一種工業(yè)重金屬具一定毒性，且易在體內(nèi)積聚，引起鎘中毒。有研究表明，長(zhǎng)期接觸鎘會(huì)引起組織衰老，腎功能損害，肝、腦、睪丸及胎盤(pán)等器官受損及產(chǎn)生腫瘤等[23]。當(dāng)體內(nèi)鎘聚集到一定程度造成細(xì)胞損害時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的一種保護(hù)機(jī)制，即細(xì)胞自噬。細(xì)胞自噬廣泛存在于生物體內(nèi)，在維持細(xì)胞穩(wěn)定性方面起著重要作用。白藜蘆醇是一種有生物化學(xué)活性的天然分子，具抗氧化、抗腫瘤功能，近年來(lái)，更有研究顯示，白藜蘆醇可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。本研究建立在HEK 293T細(xì)胞暴露在低濃度鎘24 h，其細(xì)胞狀態(tài)完好的前提下，利用透射電子顯微鏡、免疫印跡分析、激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，探討白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系及其生物學(xué)作用。

研究結(jié)果顯示鎘處理可以引起細(xì)胞中自噬體形成增多，推斷鎘可誘導(dǎo)HEK 293T細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，白藜蘆醇共處理后自噬標(biāo)志蛋白水平進(jìn)一步增強(qiáng)，表明白藜蘆醇能夠增強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的自噬效應(yīng)，這與Zhong等[24]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞凋亡和自噬活性的結(jié)果是相通的。我們發(fā)現(xiàn)溶酶體標(biāo)志蛋白cathepsin L的表達(dá)量是隨著自噬的變化而變化，運(yùn)用自噬體溶酶體融合抑制劑TG共處理后，細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白活性顯著增強(qiáng)，標(biāo)明自噬依然被激活，但溶酶體活性卻顯著降低，推斷白藜蘆醇介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)溶酶體活性變化可能依賴(lài)于細(xì)胞自噬，其起作用的階段可能發(fā)生在自噬體與溶酶體融合之前。

活性氧(ROS)被認(rèn)為是許多自噬信號(hào)通路的基本自噬信號(hào)分子。SIRT1是依賴(lài)于NAD+蛋白脫乙酰基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，在調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞自噬和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[25]。體內(nèi)外很多研究結(jié)果表明，鎘中毒會(huì)引起體內(nèi)外各種細(xì)胞ROS水平增加，而白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)水平降低細(xì)胞ROS含量，達(dá)到抑制機(jī)體氧化應(yīng)激的作用[26]。Ping等[27]也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將人HTR8/SVneo細(xì)胞系暴露于H2O2建立氧化應(yīng)激體外模型，RSV共處理可通過(guò)誘導(dǎo)SIRT1依賴(lài)性自噬以預(yù)防H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，白藜蘆醇可降低鎘誘導(dǎo)的ROS水平，并在H2O2作為陽(yáng)性對(duì)照的基礎(chǔ)上顯示，白藜蘆醇對(duì)鎘誘導(dǎo)的自噬與對(duì)H2O2誘導(dǎo)的作用機(jī)制可能相同，依賴(lài)于其抗氧化能力，且在作用過(guò)程中SIRT1表達(dá)顯著上升，說(shuō)明SIRT1起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，推測(cè)白藜蘆醇可能是通過(guò)激活SIRT1來(lái)增強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。這與白藜蘆醇通過(guò)介導(dǎo)SIRT1和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)線粒體吞噬作用，從而保護(hù)骨質(zhì)疏松大鼠的成骨細(xì)胞[28]的結(jié)果一致。

除此之外，前期很多報(bào)道都表明，細(xì)胞自噬與凋亡之間存在復(fù)雜且緊密的關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞自噬水平降低時(shí)，眾多蛋白質(zhì)和破損細(xì)胞器累積，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29]。在本研究中，我們將白藜蘆醇與高濃度鎘進(jìn)行共處理，結(jié)果顯示，白藜蘆醇可以抑制高濃度鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變。caspase-3是caspase蛋白酶家族的成員之一，在真核細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色，白藜蘆醇會(huì)降低鎘誘導(dǎo)的caspsse-3的表達(dá)，這些都表明白藜蘆醇對(duì)鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。盡管如此，細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及到眾多調(diào)控通路，所以白藜蘆醇在調(diào)控細(xì)胞凋亡上的具體作用還不得而知，仍需要我們進(jìn)一步探索。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過(guò)進(jìn)一步增強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用，并且這種增強(qiáng)發(fā)生在與溶酶體融合之前，其作用機(jī)制與白藜蘆醇的抗氧化性有關(guān)并與SIRT1激活有密切的聯(lián)系，此外，白藜蘆醇還阻礙了鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，體現(xiàn)了白藜蘆醇潛在的醫(yī)用價(jià)值。