纖維素降解菌種的篩選測定及其對秸稈的降解

黃青盈，呂嘉昕，何秋愉，武 全，劉明秋

(復旦大學 生命科學學院 上海工業(yè)菌株工程研究中心， 上海 200438)

纖維素在自然界分布廣泛，是世界上最豐富的可再生生物質資源之一。秸稈是主要的農業(yè)廢棄物，富含可利用的纖維素資源，同時亦存在難降解和難以資源化的問題。我國秸稈資源豐富，每年產量超過9億噸,但秸稈及其副產物綜合利用率平均不到40%[1]。秸稈的主要成分有灰分、纖維素、半纖維素、木質素等，在自然條件下降解緩慢。因此，傳統(tǒng)方法主要將其焚燒處理，該方法效率低、耗能大且會造成較為嚴重的環(huán)境污染。我國也出臺了對焚燒秸稈的禁令，但要從根本上解決秸稈處理問題，重點在于使用更有效且環(huán)保的處理方式，使之分解成為可利用的生物質能源、肥料、易消化的飼料及制造原料。禾本類造紙傳統(tǒng)技術是加入堿液蒸煮，會產生大量黑液造成嚴重環(huán)境污染，我國從90年代末就全面關停所有草類造紙項目。隨著國家禁止洋垃圾的進口和禁塑令的實施，結合國內草多木少的國情，很多研究都把目光集中在水稻、小麥秸稈上。考慮到環(huán)保需求，需要采用生物方法與機械方法結合，用生物方法對秸稈進行制漿預處理，去除部分木質素，熟化秸稈，提高后續(xù)步驟效率[1]。纖維素水解還可生成多種產物如乙醇、烷烴、琥珀酸、乳酸乙酯等，可作為新能源生產和資源化利用的重要原料[2]。

降解纖維素的方法包括物理法、化學法和生物法。物理法主要是使用高溫熱降解，化學法則較多使用酸堿試劑和氧化劑，這兩種方法不僅耗能大、成本高，而且處理過程會造成環(huán)境污染，產生有害副產物[3]。生物法則是利用能夠產生纖維素降解酶的細菌、真菌、放線菌等微生物來進行處理[4]，耗能少、成本低，且環(huán)境友好[5]，因此受到廣泛關注，也取得了一定成果[6]。降解纖維素和木質素的微生物有細菌、真菌和假單胞菌、鏈霉菌等放線菌[7]。真菌產纖維素酶的能力很強[8]，而細菌具有更強的環(huán)境適應性，生長更快，能夠產生特異性更高的多酶復合物[9]。劉曉飛等[10]從賽地黑土中篩選出一株能高效降解纖維素的放線菌，濾紙酶活性(FPA)達到(11.94±0.51)U/mL，最優(yōu)條件下對玉米秸稈5 d降解率可達23.54%；孟建宇等[11]從大興安嶺森林土壤中獲取了能降解纖維素的真菌，兩株真菌羧甲基纖維素(CMC)酶活性可分別達到103.89 U/mL和158.36 U/mL；江高飛等[12]研究了能夠在高溫好氧堆肥中保持高度熱穩(wěn)定性并降解纖維素的菌株，在55～65 ℃和75 ℃條件下依舊能發(fā)揮較高的效用；張必周等[13]在低溫條件下尋找能高效降解纖維素的復配菌，在15 ℃模擬環(huán)境培養(yǎng)下濾紙酶活性(FPA)為32.96 U/mL。

為了避免物理和化學方法處理纖維素的弊端，挖掘更多更有效的纖維素處理的微生物資源，本研究擬從多種環(huán)境中分離具有降解纖維素潛力的菌種，對其進行馴化、篩選，并測定其降解纖維素和產多種與纖維素和木質素有關酶的能力。將這些菌種用于降解水稻秸稈，考察單菌及不同混合菌種的降解效果和最佳降解條件，此外還嘗試將其用于造紙原料秸稈的預處理，為秸稈的生物處理和資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與秸稈樣品

菌種分離自復旦大學食堂廚余垃圾、餐廚垃圾處理廠的廢水及處理廠周圍被廢水浸潤的土壤。

002A為實驗室已鑒定的自研混合菌劑，主要為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，常用于養(yǎng)牛場牲畜糞便及餐廚垃圾處理，用于豐富菌種，增加混合菌劑效用。

秸稈于2020年9—10月采自浙江平湖市和江蘇鹽城市水稻田，晾干切成2～3 cm小段，置于陰涼干燥處儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 材料以及儀器

酵母粉、蛋白胨購自英國Oxoid公司；葡萄糖購自華大公司；氯化鈉購自福晨化學公司；硫酸鎂、磷酸氫二鉀購自上海文旻生化科技有限公司；明膠、瓊脂、微晶纖維素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；剛果紅購自天津市大茂化學試劑場；羧甲基纖維素鈉購自湖南佰歐泰醫(yī)藥有限責任公司；分光光度計為上海菁華科技儀器有限公司產品；掃描電鏡為TESCAN公司產品，型號VEGA3。

1.2 培養(yǎng)基

馴化富集培養(yǎng)基的配制參考文獻[14]，通過梯度減少有機成分使細菌逐漸適應，以加入的濾紙片作為碳源，同時觀察馴化期間濾紙片是否發(fā)生了崩解。LB培養(yǎng)基配制： 酵母粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g，加水定容至1 000 mL，使用5 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH至7左右，121 ℃ 15 min滅菌。無機培養(yǎng)基配制： KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 3 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃ 15 min滅菌。第1次馴化培養(yǎng)基配制： 50 mL LB培養(yǎng)基中加入濾紙片1 g，121 ℃ 15 min滅菌。第2次馴化培養(yǎng)基配制： 25 mL LB培養(yǎng)基，25 mL無機培養(yǎng)基，加入濾紙片1 g，121 ℃ 15 min滅菌。第3次馴化培養(yǎng)基配制： 10 mL LB培養(yǎng)基，40 mL無機培養(yǎng)基，加入濾紙片1 g，121 ℃ 15 min滅菌。篩選培養(yǎng)基的配制參考文獻[15]： 微晶纖維素10 g，KH2PO41 g，酵母粉1 g，蛋白胨2 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，瓊脂15 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃ 15 min滅菌。驗證性質培養(yǎng)基配制采用孟建宇等[11]的方法： K2HPO40.5 g，微晶纖維素1.88 g，MgSO40.25 g，明膠2 g，剛果紅0.2 g，瓊脂1.4 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃ 15 min滅菌。產酶培養(yǎng)基的配制參考文獻[16]： 羧甲基纖維素鈉15.0 g，酵母粉5.0 g，KH2PO42.0 g，121 ℃ 15 min滅菌。秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基的配制參考文獻[17]： 100 mL LB培養(yǎng)基中加入秸稈條3 g，121 ℃ 15 min滅菌。

1.3 菌種馴化分離鑒定

將各來源菌種分別依次接種纖維素富集培養(yǎng)基馴化3次，每次馴化時于搖床中220 r/min 30 ℃培養(yǎng)7 d，并觀察培養(yǎng)基變化[18]。

將第3次馴化后錐形瓶中的菌稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基中，將涂布后形態(tài)結構不同的菌落進行分離純化，在平板純化3次后挑單克隆接入液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，置于4 ℃冰箱備用[19]。

菌種鑒定： 將分離得到的菌種接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，各取1 mL菌液加入離心管中。按照諸葛誠祥[20]的方法提取DNA進行測序鑒定。引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反應條件： 94 ℃變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,30次循環(huán)后,于72 ℃下最后延伸10 min，使反應產物擴增充分，目標片段1 500 bp。PCR產物由上海擎科生物進行測序。

1.4 降解纖維素驗證

于含有剛果紅的纖維素驗證培養(yǎng)基上三點接種分離到的各菌種。30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后觀察是否有脫色圈。由于剛果紅可與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被菌種分泌的酶分解后就會產生以菌落為中心的透明圈，以此定性驗證菌種對纖維素的降解能力[21]。

1.5 酶活力測定

采用文獻[22]的所有實驗重復3次： 菌株活化后以1%(體積比)接種量接入10 mL發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，于4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，取上清液即粗酶液加蒸餾水稀釋5倍測定酶活力[23]。

纖維素酶活力的測定采用DNS法，酶活力單位(U/L)定義為： 實驗條件下1 L酶液1 min催化底物生成1 μmol葡萄糖的量。

葡萄糖標準曲線繪制： 分別配制濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL的葡萄糖溶液，在每根試管中加入各濃度梯度葡萄糖溶液0.5 mL和pH 4.8 0.05 mol/L的K2HPO4-檸檬酸溶液各2 mL、0.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min后迅速冷卻，540 nm處測定其OD值，作出標準曲線。

羧甲基纖維素酶活力的測定底物為質量分數(shù)1%羧甲基纖維素鈉的檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L pH 4.4)，外切葡聚糖酶活底物為質量濃度1%的微晶纖維素溶液；β-葡聚糖酶活力的測定底物為質量濃度1%的水楊苷溶液；纖維素相關酶的總酶活的測定底物為1 cm×6 cm的新華濾紙1條。

在2 mL底物溶液中準確加入已稀釋的粗酶液0.5 mL，50 ℃條件下水浴30 min后加入0.5 mL DNS，沸水浴5 min后取出并立即冷卻，搖勻后在波長540 nm處測定吸光度值，對照葡萄糖標準曲線用吸光度值求出還原糖的含量然后計算出酶活力[24]。

1.6 木質素有關酶活力測定

由于秸稈中含有的木質素也是影響其降解的重要因素，因此也采用文獻[25]的方法探究其余木質素有關的酶活力，所有實驗重復3次。

木質素過氧化物酶活性測定： 底物為加入1 mmol/L白藜蘆醇的醋酸鈉緩沖液(pH 4.5，1 mmol/L)2 mL，設空白對照，水浴預熱至60 ℃后加入稀釋5倍后粗酶液0.5 mL，用1 mmol/L H2O20.5 mL啟動反應。在波長310 nm處測定體系內吸光度的增加值，1個酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1[26]。

錳過氧化物酶活性測定： 底物為加入1 mmol/L MnSO4為底物的醋酸緩沖液(pH 4.6，1 mmol/L)2 mL，設空白對照，水浴預熱至60 ℃后加入稀釋5倍后粗酶液0.5 mL，用1 mmol/L H2O20.5 mL啟動反應。在波長270 nm處測定體系內吸光度的增加值，1個酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1。

漆酶活性測定： 底物為1 mmol/L ABTS(2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))的醋酸鈉緩沖液(pH 4.5，1 mmol/L)2 mL，設空白對照，水浴預熱至60 ℃后加入稀釋5倍后粗酶液0.5 mL。在波長420 nm處測定體系內吸光度的增加值，1個酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1。

1.7 秸稈降解及條件優(yōu)化

將初篩效果較好的菌株接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，接種5%(體積比)菌液于100 mL秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中，對照加相同體積無菌水。分別置于30 ℃、220 r/min恒溫培養(yǎng)7 d后將發(fā)酵后的秸稈殘渣從錐形瓶倒出并用無菌水沖洗干凈，然后置于高溫烘箱中65 ℃烘干8 h至恒重，取出烘干后的秸稈稱重并計算秸稈相對降解率=(W0-W)/W0×100%，W0為對照秸稈殘渣干重，W為降解后秸稈殘渣干重，每株菌重復3次[27]。

選取部分效果較好的菌種，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后測定OD600，以其中最低的一組為標準，其余各組稀釋至OD600相同后以等比例混合，組成多種混合菌劑以5%的接種量分別接種秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵后測定相對降解率選出最佳組合，重復3次。

選取最佳效果的混合菌種，分別置于3組單一條件變量的情況下測定不同條件變化對于秸稈降解率的影響，重復3次： 發(fā)酵前菌種培養(yǎng)初始pH分別為5、6、7、8、9；培養(yǎng)基碳源含量分別為1、2、3、4、5 g/L；發(fā)酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃[28]。

1.8 掃描電鏡觀察

將最佳纖維素降解菌發(fā)酵處理后的秸稈和原始秸稈在4 ℃條件下用2.5%戊二醛固定液液浸泡1 d，然后用濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液依次處理10 min，放入冷凍干燥儀中脫水處理1 d。干燥好的秸稈細條經(jīng)過噴金處理后在掃描電子顯微鏡下觀察秸稈在處理前后表面的差異[29]。

1.9 秸稈造紙制漿預處理

以002A及本實驗篩選得到的菌種為實驗菌種，每組各取100 g秸稈裝入杯中，菌液接種量為秸稈重量的10%，加水700 mL浸沒秸稈翻攪均勻，放入培養(yǎng)箱，40 ℃培養(yǎng)，第3、5、7天觀察并送樣至造紙廠檢測[30]。后續(xù)使用20%接菌量和100 mL LB培養(yǎng)基加10%接菌量以改進效果。

2 結果與分析

2.1 菌種分離鑒定

馴化過程中觀察到濾紙條的崩解。經(jīng)過多次馴化和篩選，分離出單菌落后進行16S rRNA鑒定，得到以下11個菌株： X1(Bacilluscereus)、X2(Bacillusthuringiensis)、X3(Alcaligenesfaecalis)、X4(Bacilluscereus)、Y1(Bacilluscereus)、Y3(Alcaligenesfaecalis)、X5(Bacilluscereus)、X8(Bacillussp.)、X9(Bacilluscereus)、X10(Klebsiellaoxytoca)、X11(Citrobacterfreundii)，其相似度如表1所示。進一步使用Mega軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析Bacilluscereus屬的5個菌株(X1、X4、X5、X9、Y1)以及與它們類似的模式菌株，結果如圖1所示。

表1 各菌株鑒定結果

圖1 B.cereus屬的5個菌株系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of five B.cereus strains

2.2 降解纖維素驗證

由于剛果紅可與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被菌種分泌的酶分解成小分子糖等物質后就會產生以菌落為中心的透明圈，以此驗證菌種對纖維素降解能力，11個菌株在驗證培養(yǎng)基上的透明圈直徑見表2，降解較好的菌種為X1、X2、X4、X8、Y1。

表2 各菌株脫色圈直徑和菌落直徑比值

2.3 纖維素有關酶活測定

將所得菌種活化后接種發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后離心獲得粗酶液，進一步測定這些菌種產生的與纖維素有關的酶活力來定量衡量其降解纖維素的能力，結果如圖2所示： 羧甲基纖維素酶活力最高的菌株為Y1，酶活力達到了331.79 U/L，除此之外，X2、X8、Y1的羧甲基纖維素酶活力也較高，均達到300 U/L以上。外切葡聚糖酶活力最高的菌株為X8，酶活力達到了314.85 U/L，除此之外，外切葡聚糖酶活力較高的菌株還有X2、X5，均達到300 U/L以上。X10的β-葡聚糖酶酶活力最高，達到了307.91 U/L，X3、X5、Y3的β-葡聚糖酶酶活力也達到了290 U/L以上。濾紙酶活力最高的菌株為Y1，酶活力達到了370.52 U/L，另外超過320 U/L的菌株有X1、X2、X10、Y1。前3種酶均為纖維素降解過程中共同作用的酶，濾紙酶活力則代表纖維素相關酶總酶活力，因此選取各種酶活力都相對較高的X1、X2、X5、X8、X10、Y1、Y3組成1號混合菌種參與后續(xù)的秸稈降解混合菌實驗。

2.4 木質素有關酶活的測定

將粗酶液稀釋5倍后測定與木質素有關的酶活力，設空白對照計算其吸光度增加值，1個酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1，結果如圖3所示。木質素過氧化物酶活力較高的菌株有X2、X3、X5，其中最高的是X2，酶活力達到1 388 U/mL，其余的也均在1 000 U/mL以上；錳過氧化物酶活力較高的菌株有X2、X3、X5、X11、Y3，其中最高的是X2，酶活力達到316 U/mL，其余也均在200 U/mL以上；漆酶活力較高的菌株有X2、X3、X5，其中最高的是X2，酶活力達到696 U/mL，其余也均在300 U/mL以上。因此選取X2、X3、X5這3種與木質素有關的酶活力均較高的菌株組成2號混合菌種參與后續(xù)的秸稈降解混合菌實驗。

圖2 菌株纖維素酶活力Fig.2 Cellulase activity of each strain底物分別為羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、水楊苷和濾紙，DNS法測定酶活力.

圖3 菌株木質素有關酶活力Fig.3 Lignin-related enzyme activities of each strain底物分別為白藜蘆醇、MnSO4、ABTS，分光光度法測定酶活力.

2.5 秸稈降解及條件優(yōu)化

將11個菌株接種至加入秸稈條的培養(yǎng)基中，以無菌水為對照，稱量培養(yǎng)7 d后秸稈剩余干重并計算降解率，結果如圖4所示。對秸稈降解效果最好的菌株為X2，達到21.64%，除此之外超過15%的菌株還有X1、X4和X5。將本實驗篩選得到的混合菌(篩選混，包括X1、X2、X3、X4、X5、X8、X9、X10、X11，Y1、Y3)、2.3節(jié)中提到的1號混合菌、2.4節(jié)中提到的2號混合菌以及所有菌株混合(ALL混，包括篩選混合菌和002A，002A用于豐富菌種和改進降解效果)作為4組混合菌種，進行秸稈發(fā)酵，培養(yǎng)7 d后計算相對降解率，使用R分析對這4組混合菌的降解率進行統(tǒng)計學分析，得到結果為F=31.1>F0.05(3,8)=4.07，P=0.000 9<0.05，因此秸稈相對降解率差異顯著，即這4種菌對于秸稈降解能力有差異。平均相對降解率見表3，所有菌種混合(ALL混合)降解秸稈效率最高，降解率達到了23.86%。選取最佳混合菌種即所有菌種混合菌劑，測定3種不同條件變量即發(fā)酵前菌種培養(yǎng)初始pH(發(fā)酵pH仍為正常值即pH=7以避免秸稈被酸性或堿性溶液腐蝕影響實驗效果)、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基碳源含量對秸稈降解效率的影響。菌種培養(yǎng)pH對秸稈降解率有顯著影響，F(xiàn)=268.6>F0.05(4,10)=3.48，P<0.000 1，結果如圖5所示。秸稈的降解率在菌種活化培養(yǎng)條件呈酸性和堿性的時候明顯降低，隨著pH值的上升，降解率先降后升，pH=7時降解效率最佳，為23.92%。碳源含量對秸稈降解率有顯著影響，F(xiàn)=5.887>F0.05(4,10)，P=0.010 6<0.05，碳源量為1 g/L 時降解率最高為24.61%。發(fā)酵溫度對秸稈降解率有顯著影響，F(xiàn)=74.21>F0.05(4,10)，P<0.000 1，隨著發(fā)酵溫度的上升，秸稈的降解率逐漸上升然后下降，35 ℃時達到最高降解率25.08%。因此，秸稈降解的最佳條件為發(fā)酵液pH為7，發(fā)酵溫度為35 ℃，培養(yǎng)基碳源量為1 g/L。

圖4 菌株秸稈降解率Fig.4 Straw degradation rate of each strain

表3 混合菌秸稈降解率

圖5 3種條件變量對秸稈降解率的影響Fig.5 The influence of three condition variables on straw degradation rate發(fā)酵前菌種培養(yǎng)初始pH(發(fā)酵pH仍為正常值即pH=7以避免秸稈被酸性或堿性溶液腐蝕影響實驗效果)分別為5，6，7，8，9；培養(yǎng)基碳源含量分別為1，2，3，4，5 g/L；發(fā)酵溫度分別為20，25，30，35，40 ℃.

2.6 掃描電鏡觀察

比較最佳條件下混合菌劑發(fā)酵前后秸稈經(jīng)固定干燥噴金處理后在掃描電子顯微鏡下的圖像，尺度為200 μm，放大200倍，結果見圖6.可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前秸稈結構較為完整，表皮光滑，發(fā)酵后秸稈發(fā)生了缺刻斷裂，可以看到混合菌劑對于秸稈結構具有一定的破壞能力，體現(xiàn)了其降解能力。

圖6 發(fā)酵前后秸稈掃描電鏡圖像Fig.6 SEM images of straw before and after fermentation注： 尺度200 μm，放大200倍.

2.7 秸稈造紙制漿預處理

要達到后續(xù)機械操作的條件，需要將纖維細胞的細胞壁打破，讓細胞吸水至飽和，使纖維比重近似于水，可以懸浮在水中。以10%濃度接種量處理大量秸稈時，所有降解秸稈混合菌種5 d處理效果最好，達到了一定的軟化且并未過度腐爛。該混合菌劑后續(xù)增加接入濃度至20%或接種量10%并加入100 mL LB培養(yǎng)基3 d后接近接種量10%的樣本6 d的效果，縮短了處理時間。目前可以達到以下處理效果： (1) 熟化秸稈，樣本手感相對柔軟；(2) 粉碎成造紙需要的長度后，在水中攪拌，樣本有5%～10%左右的纖維懸浮在水中；(3) 20%濃度的樣本攪拌后，所排出的水相對潔凈。經(jīng)機械處理后，接菌量為10%和20%的秸稈所制作的粗漿樣本如圖7所示，接菌量20%的樣本較為細膩，孔隙較小，耐折度達到5～6次，灰廢不超過15%，能夠作為后續(xù)機械操作的原料使用。

圖7 不同接菌量預處理的秸稈粗漿制片F(xiàn)ig.7 Preparation of coarse straw pulp pretreated with different inoculation amounts

3 討 論

本研究采用梯度營養(yǎng)培養(yǎng)基馴化的方法來強化篩選能夠降解纖維素的菌種，菌種來源于含有豐富纖維素的廚余垃圾及被其污染的水和土壤，本文實驗中主要將其用于降解高纖維素含量的秸稈。微生物降解秸稈相比物理和化學方法對于環(huán)境的影響最小，符合目前環(huán)保發(fā)展的需求，避免了處理過程中造成更大的次生污染。本研究所篩選菌種均屬于細菌，雖然很多真菌比如白腐真菌等降解纖維素能力很強[31]，但是細菌具有環(huán)境適應能力強、數(shù)量多、種類豐富、易于獲取等優(yōu)勢，后續(xù)還可以考慮進行遺傳修飾構建工程菌株進一步提高其降解能力。本研究篩選出的菌株具有產纖維素酶及產木質素酶的能力，也可作為酶制劑的來源。

考慮到秸稈難降解的原因主要是含有纖維素和木質素，因此，將部分酶活力較高的單菌混合來處理秸稈，最終發(fā)現(xiàn)降解效果最佳的是所有菌種混合得到的菌劑?？赡苁蔷N多樣性提高使菌群結構更加豐富、均勻,且碳水化合物的代謝通路豐度提高，改善了其生長和產酶能力。不同的降解菌對纖維素中不同成分降解具有一定的特異性，多種菌株混合可以通過酶系互補達到產酶周期縮短、產酶能力增強、提高降解效率的效果[28]，但不同菌種之間可能存在合作促進作用也可能存在競爭拮抗作用，本研究由于研究周期限制未對此作出深入探討，但不同菌種酶系的相互作用和整體混合菌群的生態(tài)特點也可以作為后續(xù)研究的一個方向[32]?？紤]到復合菌系之間的拮抗作用，一些促進秸稈降解微生物增殖的營養(yǎng)液作為秸稈助腐劑也能使秸稈降解效率有所提升，成為秸稈降解研究的另一出路[33]。

也有很多學者對產纖維素酶的菌種培養(yǎng)條件(包括碳源、氮源、金屬鹽、培養(yǎng)溫度、pH值、金屬離子影響、接種量和誘導物質量濃度等)進行了研究[34-36]。對秸稈降解條件的測定結果表明，培養(yǎng)時過酸或者過堿均會嚴重影響菌種生長，導致秸稈降解效果急劇下降，自然條件下混合菌劑效果最佳；適當升高溫度有助于菌種快速生長和秸稈熟化降解，但是溫度過高也可能影響菌種生長，降低降解效率，但是也保持在一個比較高的效率水平，在大規(guī)模堆肥處理秸稈過程中也可以考慮使用本實驗得到的菌種進行輔助處理；碳源充足時，細菌生長較快因此降解秸稈效率也比較高，而適當減少碳源量會使細菌增加對秸稈的利用，因此可以實現(xiàn)減少資源消耗而獲得較高降解效率的目的。本研究所使用混合菌劑處理秸稈的發(fā)酵條件并不苛刻，可以在自然狀態(tài)下投入使用且效果較好。

本研究將纖維素降解菌初步應用于造紙制漿預處理，發(fā)現(xiàn)可以在較短時間內實現(xiàn)對于秸稈的熟化，使其吸收更多液體，纖維更符合后續(xù)機械處理的要求，也為秸稈處理應用作為造紙原料[37]提供了新的可能性。