黑果小檗果總花色苷提取工藝優(yōu)化及熱降解動(dòng)力學(xué)研究

劉 菁，孫吉祥，李 倩，高 英

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)研究所，新疆烏魯木齊 830001）

黑果小檗（Berheris heteropoda Schrenk） 是小檗科小檗屬灌木，在新疆阿爾泰山、天山、巴爾魯克山及周邊蒙古和哈薩克斯坦海拔800～1 200 m 的山中均有分布。根據(jù)《新疆植物志》 （1999 年版） 記載，黑果小檗果實(shí)成熟后顯紫黑色，故得名[1]。研究表明黑果小檗果實(shí)含有豐富的花色苷[2]，由于花色苷的抗氧化性、抗癌[3]、防治心血管系統(tǒng)疾病、降血糖[4]、改善大腦功能等作用[5-6]，有關(guān)黑果小檗中花色苷引起了人們的研究興趣。

目前，花色苷提取方法有溶劑直接提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法[7]、酶提取法、回流提取法[8]、超臨界CO2提取法等[9]。超聲作用可以大幅縮短提取時(shí)間[10]，纖維素酶和果膠酶可以有效破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，有利于提取溶劑與目標(biāo)物質(zhì)接觸[11-12]。以黑果小檗果總花色苷（Berheris heteropoda Schrenk total anthocyanins，BHSTA） 提取率為考查指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法（Response Surface Method，RSM） 優(yōu)化了酶- 超聲波輔助提取工藝。提取純化后的花色苷極不穩(wěn)定，易被氧化[13]，在pH 值、溫度、光照等因素作用下，容易降解破壞[14]。試驗(yàn)進(jìn)一步對溫度和pH 值2 個(gè)因素對BHSTA的降解作用進(jìn)行研究，建立BHSTA 熱降解動(dòng)力學(xué)模型，以期為充分開發(fā)利用黑果小檗果實(shí)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥材黑果小檗果實(shí)于2019 年9 月采自新疆烏魯木齊市南山山區(qū)。晾干后，仔細(xì)篩選，丟棄已破損、腐敗果實(shí)，挑選飽滿優(yōu)良的黑果小檗干果，去除果莖及種子。用藥材粉碎機(jī)將果皮粉碎、過20 目篩，置于-20 ℃冰箱中避光存放。

果膠酶，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司提供；無水乙醇，天津永晟精細(xì)化工有限公司提供；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、乙酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WV-754 型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；AS10200AD 型超聲波清洗機(jī)，天津奧特賽恩儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；SCIENTZ-10ND 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；RE-53A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；SHB-4 循環(huán)水多用真空泵，寧波杜甫儀器廠產(chǎn)品；PHS-26 型數(shù)顯pH 計(jì)，上海精密試驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，北京博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花色苷含量測定

應(yīng)用pH 示差法測定BHSTA 的含量[15]。配置pH 值1.0 緩沖液、pH 值4.5 緩沖液，備用。吸取待測BHSTA 提取液2 mL 至離心管中，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心5 min。精密量取0.5 mL 上清液至10 mL 棕色容量瓶中，平行2 份，分別用pH 值1.0 緩沖液、pH 值4.5緩沖液定容至刻度，放置10 min 后于波長517 nm 和700 nm 處測定吸光度。結(jié)果以每1 g 果實(shí)含相當(dāng)于矢車菊素-3-O-糖苷（Cy-3G） 的含量計(jì)算，計(jì)算公式（1）、（2） 表示：

式中：

MW——矢車菊素-3-糖苷分子量（449.2 g/mol）；

ε——矢車菊素-3-O-糖苷摩爾消光系數(shù)（26 900 L/(cm·mol）；

DF——稀釋倍數(shù)；

L——吸收池厚度（1 cm）；

V——提取體積，mL；

m——果皮粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1） pH 值對提取率的影響。稱取果實(shí)粉末2.0 g，以80%乙醇為溶劑，固定料液比1∶30（g∶mL），提取溫度40 ℃，提取時(shí)間40 min 和酶添加量1.0%條件下，探討pH 值2，3，4，5，6 對花色苷提取率的影響，確定最合適提取pH 值。

（2） 溫度對提取率的影響。稱取黑果小檗果實(shí)粉末2.0 g，以80%乙醇為溶劑，固定料液比1∶30（g∶mL），酶解pH 值2，提取時(shí)間40 min 和酶添加量1.0%條件下，探討提取溫度30，40，50，60，70 ℃對花色苷提取率的影響，確定最合適提取溫度。

（3） 提取時(shí)間對提取率的影響。取黑果小檗果實(shí)粉末2.0 g，以80%乙醇為溶劑，固定料液比1∶30（g∶mL），酶解pH 值2，提取溫度40 ℃和酶添加量1.0%條件下，探討提取時(shí)間10，20，30，40，50 min 對花色苷提取率的影響，確定最合適提取時(shí)間。

（4） 酶添加量對提取率的影響。取黑果小檗果實(shí)粉末2.0 g，以80%乙醇為溶劑，固定料液比1∶30（g∶mL），酶解pH 值2 和提取溫度40 ℃條件下，探討酶添加量1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%對花色苷提取率的影響，確定最合適酶添加量。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酶解pH 值、酶解溫度、酶添加量為觀察變量，采用Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行三因素三水平的工藝條件優(yōu)化。

響應(yīng)面（RSA） 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面（RSA） 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 BHSTA 降解動(dòng)力學(xué)研究

（1） BHSTA 的提取。按照響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝，稱取一定量的黑果小檗果實(shí)粉末，置避光錐形瓶中，室溫超聲提取3 次，過濾后合并濾液，38 ℃下旋蒸得到濃縮液，置于-20 ℃冰箱中低溫避光儲(chǔ)存，備用。

（2） BHSTA 的純化。選用XDA-7A 型大孔樹脂分離純化BHSTA[16]，層析柱徑長比1∶8，上樣流速調(diào)整到2 mL/min，上樣后靜置過夜，采用鹽酸酸化的純化水沖洗10 h，流速控制在1.5～2.0 mL/min。洗脫液為鹽酸酸化的50%乙醇溶液，pH 值為1.0，洗脫液用量為6 BV。洗脫液在40 ℃減壓旋蒸出乙醇溶劑得BHSTA 濃縮液，于-80 ℃下凍干后得到BHSTA 凍干粉，全程注意避光。

（3） 不同pH 值的BHSTA 的配制。提前用2 mol/L HCl 和2 mol/L NaOH 溶液配置pH 值分別為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 的溶液。稱取相同量的BHSTA凍干粉，用相同體積的不同pH 值溶液溶解，備用。

（4） pH 值和溫度對BHSTA 降解的影響。分別吸取不同pH 值的BHSTA 溶液裝入EP 管內(nèi)封口，pH 值的溶液平行5 份，放入不同溫度（60，70，80，90 ℃） 水浴中避光加熱8 h。過程中每1 h 間隔取出1 個(gè)樣品，放入冰水中快速降溫，采用1.3.1 方法測定濃度。分別計(jì)算一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的速率常數(shù)（k）、降解半衰期（t1/2）、并采用Arrhenius 方程計(jì)算活化能Ea，相關(guān)公式如（3） ～（5） 表示：

式中：

C——花色苷終質(zhì)量濃度，mg/L；

C0——花色苷初始質(zhì)量濃度，mg/L；

k——熱降解反應(yīng)常數(shù)，h-1；

k0——頻率常數(shù)，h-1；

R——?dú)怏w常數(shù)8.314 J/(mol·K)；

T——反應(yīng)溫度，K；

Ea— —活化能，kJ/mol；

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3 次。采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)采用Graphpad prism 7.0 繪圖軟件作圖，采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

各影響因素對BHSTA 提取率的影響見圖1。

圖1 各影響因素對BHSTA 提取率的影響

由圖1（a） 可知，在果膠酶的催化作用下，pH值為2～3 時(shí)，BHSTA 的提取率隨著pH 值上升而提高，當(dāng)pH 值為3 時(shí)提取率為0.97%。pH 值繼續(xù)提高則BHSTA 的提取率下降，初步選取pH 值3 為最適宜值。由圖1（b） 可知，提取溫度50 ℃時(shí)BHSTA 的提取率為1.19%，初步選取50 ℃為最適宜溫度。由圖1（c） 可知，果膠酶存在時(shí)提取30 min，總花色苷的提取率為1.26%。延長提取時(shí)間并不再顯著改善提取率，反而有下降趨勢，初步選取30 min為最適宜時(shí)間。由圖1（d） 可知，BHSTA 提取率隨酶用量的增加呈上升后下降的趨勢，當(dāng)酶添加量為2%，BHSTA 的提取率最高，為1.35%。初步選取1.35%為最適宜酶添加量。

2.1.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)確定的最適宜參數(shù)，以pH 值、溫度、酶添加量為觀察因素，采用三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果見表2，響應(yīng)面方差分析二次模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果

多參數(shù)的回歸方程如公式（6）：

由表3 可知，響應(yīng)面回歸模型顯著性極佳（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.079 5），回歸模型決定系數(shù)0.996 9，該模型能解釋99.69%變化。模型擬合度較好，該模型對酶-超聲輔助BHSTA 提取工藝的參數(shù)優(yōu)化穩(wěn)定性較好。模型中一次項(xiàng)A，B，C 參數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.000 1），二次項(xiàng)A2，B2，C2參數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），交叉項(xiàng)AB 參數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），BC，CD 參數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。對一次項(xiàng)A，B，C 的F 值分析，確定參數(shù)對BHSTA 提取率的影響大小依次為溫度＞酶添加量＞pH 值。

表3 響應(yīng)面方差分析二次模型方差分析

2.1.3 交互效應(yīng)分析

各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖2。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

依據(jù)建立的回歸方程得到對應(yīng)的等高線及曲面圖，進(jìn)一步分析交互作用對提取率的影響。由圖2可知，A 與B 的交互作用響應(yīng)面圖中，曲度較為陡峭，交互作用明顯，等高線呈現(xiàn)橢圓狀，亦顯示交互作用明顯，結(jié)論與回歸方程方差分析結(jié)果相同。而A，C 響應(yīng)曲面坡度較為平緩，B，C 的響應(yīng)曲面坡度雖可見陡峭，但二者的等高線均趨向圓形，可見交互作用不明顯。

2.1.4 最佳提取條件的確定和驗(yàn)證

通過對回歸模型分析得出BHSTA 提取的最佳工藝參數(shù)為pH 值3.95，酶解溫度52.68 ℃，酶添加量2.33%；得到BHSTA 提取率預(yù)測值為1.37%；再以以上參數(shù)進(jìn)行最優(yōu)工藝驗(yàn)證，試驗(yàn)平行進(jìn)行3 次，得到BHSTA 提取率為1.35%，與預(yù)測值相近。該工藝參數(shù)具有一定的準(zhǔn)確性和可靠性。

低溫是提取和純化花色苷的必要條件[17]。采用酶-超聲輔助提取法BHSTA 在低溫下獲得較高的提取率。由于超聲的高能量，使得分子運(yùn)動(dòng)加速，沖擊頻率增加，導(dǎo)致細(xì)胞壁的通透性增加，溶劑更容易與花色苷分子接觸[18]，提取時(shí)間大幅減少，且操作方法簡單、成本低廉[19]。酶能促進(jìn)細(xì)胞壁的解體，促進(jìn)目標(biāo)物質(zhì)的釋放，適宜的溫度可以維持酶的活性，也可以維持花色苷的穩(wěn)定性。超聲與酶助提取的聯(lián)合應(yīng)用，可以達(dá)到更高目標(biāo)收率。雖然酶有利于目標(biāo)物質(zhì)的提取，但酶的作用并不總是積極的[20]。當(dāng)酶用量達(dá)到一定水平時(shí)，進(jìn)一步增加可能會(huì)降低目標(biāo)物的提取率[21]，同時(shí)酶受到變性和引入新雜質(zhì)的限制[22]。

2.2 BHSTA 熱降解動(dòng)力學(xué)

2.2.1 不同pH 值和溫度下BHSTA 的熱降解參數(shù)

BHSTA 在不同溫度和pH 值條件下的降解見圖3，不同pH 值下的BHSTA 熱降解參數(shù)見表4。

圖3 BHSTA 在不同溫度和pH 值條件下的降解

表4 不同pH 值下的BHSTA 熱降解參數(shù)

圖3 顯示了pH 值為1.0～5.0 和溫度為50～80 ℃條件下BHSTA 降解規(guī)律。不同溫度條件下，ln(C/C0)與時(shí)間變化符合線性規(guī)律（R2＞0.99），說明BHSTA降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，與其他文獻(xiàn)記載的花色苷降解規(guī)律相一致。在研究的pH 值范圍內(nèi)，BHSTA 的熱降解速率與溫度呈正相關(guān)，表現(xiàn)為熱降解反應(yīng)常數(shù)K 的增大和半衰期t1/2的變小。pH 值為1.0～5.0 時(shí)，溫度越高，隨著時(shí)間延長，花色苷含量下降越快，表明花色苷降解速率越快?；罨蹺a是體系穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，pH 值1.0～5.0 體系中，Ea在pH 值1.0 時(shí)最高，此時(shí)需要更多的能量來降解，BHSTA 最為穩(wěn)定。在pH 值5.0 時(shí)最低，此時(shí)需要較少的能量，反應(yīng)較易進(jìn)行，降解較快，BHSTA熱穩(wěn)定性最差。

2.2.2 溫度和pH 值對BHSTA 一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)的影響

溫度、pH 值對BHSTA 一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)的影響見圖4。

圖4 溫度、pH 值對BHSTA 一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)的影響

由圖4（a） ～（b） 可知，pH 值相同時(shí)，隨著溫度的升高，反應(yīng)速率常數(shù)k 的升高呈指數(shù)型加快的特點(diǎn)，半衰期t1/2則呈指數(shù)減小的特點(diǎn)。隨著體系pH值增大，反應(yīng)速率常數(shù)隨溫度升高而增長速度在加快，曲線更加陡峭，半衰期隨溫度升高快速變小，趨于同一水平。由圖4（c） ～（d） 可知，相同的溫度時(shí)，隨著pH 值的增大，反應(yīng)速率常數(shù)k 的升高呈指數(shù)型加快的特點(diǎn)，半衰期t1/2則呈指數(shù)型減小的特點(diǎn)。反應(yīng)速率常數(shù)隨pH 值升高而增長速度在加快，曲線更加陡峭，半衰期隨溫度升高快速變小，趨于同一水平。

溫度是BHSTA 最為重要的影響因素。其機(jī)制為花色苷首先發(fā)生水解或去糖基開環(huán)反應(yīng)，然后形成查耳酮或其同分異構(gòu)體α -二酮，最后降解為酚酸和醛類[23]。有研究表明，花色苷的結(jié)構(gòu)變化過程中，花色苷的二苯基苯并吡喃陽離子（AH+） 的失電子過程AH+→A 是放熱過程，水解反應(yīng)AH+→B（甲醇假堿） 和開環(huán)反應(yīng)B→C（查爾酮） 是吸熱反應(yīng)，并且向著熵增大方向進(jìn)行。溫度升高時(shí)，平衡向著無色的甲醇假堿和查爾酮形式轉(zhuǎn)化，熱降解速率加快[24]。

pH 值亦對BHSTA 穩(wěn)定性尤為重要。當(dāng)介質(zhì)的pH 值不同時(shí)，花色苷的分子結(jié)構(gòu)也以不同形式存在。當(dāng)pH 值＜2.0 時(shí)顯紅色，主要以2-苯基苯并吡喃陽離子（AH+） 的形式存在；當(dāng)pH 值為4～5 時(shí)，顏色逐漸由紅色變?yōu)樗{(lán)色，此時(shí)花色苷存在形式為醌型堿（B）。可能的機(jī)制是在pH 值2.0～4.0 的介質(zhì)中，花色苷的C3 糖苷率先發(fā)生水解，苷元進(jìn)一步通過水合反應(yīng)生成花色素的假堿形式，最后通過異構(gòu)化產(chǎn)生查爾酮及其同分異構(gòu)體α -二酮。由于產(chǎn)物中依然有查爾酮糖苷，一種解釋可能是花色苷先生成假堿葡萄糖苷，再通過開環(huán)反應(yīng)生成查爾酮糖苷[25]。查爾酮糖苷進(jìn)一步脫去糖苷成為查爾酮和其同分異構(gòu)體α -二酮，最終降解為酚酸和醛類。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對BHSTA 的酶-超聲波輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。最終建立了回歸方程，得到了BHSTA 的最適合提取工藝參數(shù)為酶解pH 值3.95，酶解溫度52.68 ℃，酶添加量2.33%，可使BHSTA 的提取率達(dá)到1.37%。BHSTA 的降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，溫度和pH值2 個(gè)因素都是BHSTA 穩(wěn)定性的重要影響因素，酸性環(huán)境和低溫條件下，熱穩(wěn)定性較好。