液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香蕉中吡蟲啉的不確定度評(píng)定

賈映霞

（北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，北京 101300）

香蕉作為熱帶水果，屬于芭蕉科，位列聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織制定的世界糧食作物榜的第4 位。同時(shí)，它還是世界經(jīng)濟(jì)作物的第8 位。所有的熱帶水果中，香蕉的消耗量是世界上最高的。國(guó)內(nèi)香蕉大多產(chǎn)自海南、兩廣、福建和云南[1-2]。香蕉含有大量維生素、膳食纖維等人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也含有少量生物活性成分，如多酚與黃酮等[3-4]。香蕉具有潤(rùn)腸通便、改善代謝綜合征、治療腹瀉和抗氧化等保健功能[5-9]。在香蕉的種植過(guò)程中難免受到病蟲害的威脅，現(xiàn)階段防治香蕉病蟲害的主要手段是化學(xué)藥劑防護(hù)。吡蟲啉是一種硝基亞甲基類殺蟲劑，主要用于糧食作物以及果蔬防治蚜蟲等蟲害，其原理是破壞農(nóng)業(yè)害蟲的煙酸乙酰膽堿酯酶受體，以達(dá)到麻痹害蟲神經(jīng)從而使害蟲死亡的目的。吡蟲啉的使用會(huì)對(duì)糧食作物及果蔬造成不同程度的藥物殘留[10]。

《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規(guī)定吡蟲啉的ADI 值是0.06 mg/kg bw，吡蟲啉在香蕉內(nèi)的最大殘留限量為0.05 mg/kg[11]。該標(biāo)準(zhǔn)也規(guī)定了香蕉中吡蟲啉的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)可參考《水果和蔬菜中450 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20769—2008）[12]、《水果、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留的測(cè)定 高效液相色譜法》（GB/T 23379—2009）[13]。

近年來(lái)，水果中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問(wèn)題層出不窮，因此檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性非常重要。不確定度可評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。本研究以《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[14]和《水果和蔬菜中450 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20769—2008）[12]為依據(jù)，科學(xué)研究了測(cè)定香蕉中吡蟲啉含量的不確定度。明確實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的主要因素，以期為水果中吡蟲啉的準(zhǔn)確測(cè)定提供參考，同時(shí)使本實(shí)驗(yàn)室能更好地滿足《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（CNAS—CL01：2018）[15]中日常檢驗(yàn)工作質(zhì)量控制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉，購(gòu)買于生鮮超市；甲苯、甲酸溶液（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；乙腈、甲醇（色譜純，沃凱公司）；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純）；無(wú)水硫酸鈉（分析純）；Sep-Pak Vac 氨基固相萃取柱（1 g，6 mL，安譜公司）。標(biāo)準(zhǔn)品：吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg，純度為98.00%，CHEM SERVCE）。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)UPLCMS/MS-8050（日本島津）；N-EVAP112 氮?dú)獯蹈蓛x（美國(guó)Organomation 公司）；2323K 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle 公司）；Milli-Q 高純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；XP205 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SNMXZ1601精度勻漿器（美國(guó)OMNi 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制（1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.010 0 g 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg，純度為98.00%）于10 mL 容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇溶液溶解樣品并定容，手動(dòng)搖晃瓶身使其混合均勻。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備（1 μg/mL）：取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1 mL 于100 mL 容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇溶液定容，搖晃均勻，備用。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線的制備：準(zhǔn)備7個(gè)10 mL 容量瓶，分別取吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL 和0.80 mL。加入甲醇溶液定容到刻度，得到的溶液濃度分別為0.001 μg/mL、0.002 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL、0.040 μg/mL 和0.080 μg/mL。

1.3.2 樣品前處理

向100 mL 離心管內(nèi)加入20.00 g 香蕉樣品、40 mL 乙腈。以高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行1 min 的勻漿提取，搗碎機(jī)的轉(zhuǎn)速為15 000 r/min。加入5 g NaCl 進(jìn)行1 min 的 勻 漿 提 取， 在3 800 r/min 條 件 下 離 心5 min，離心完成后，吸取20 mL 上清液，并于40 ℃水浴環(huán)境下旋轉(zhuǎn)濃縮至體積為1 mL 左右，待凈化。

在Sep-Pak Vac 柱中加入高度約2 cm 的無(wú)水Na2SO4，并將其放置在下方放有雞心瓶的支架上。在樣品加入前，要先使用甲苯與乙腈的混合物4 mL對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行清洗（甲苯與乙腈的體積比為1 ∶3）。待液面與Na2SO4的頂部持平，以較快的速度把樣品的濃縮液轉(zhuǎn)移到凈化柱內(nèi)，與此同時(shí)替換為新雞心瓶接收液體。使用與前述體積比相同的甲苯與乙腈的混合液2 mL 對(duì)樣品瓶進(jìn)行洗滌，共需洗滌3 次。洗滌完成后，將清洗液轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)。在柱上安裝容量為50 mL 的儲(chǔ)液罐，使用甲苯與乙腈的混合物25 mL 進(jìn)行洗脫（甲苯與乙腈的體積比為1 ∶3）。在雞心瓶?jī)?nèi)混勻，在40 ℃的水浴環(huán)境中旋轉(zhuǎn)濃縮至0.5 mL 左右為止。濃縮液用氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，快速加入水與乙腈的混合液1 mL 混合均勻（水與乙腈的體積之比為2 ∶3），用0.2 μm 的濾膜過(guò)濾，過(guò)濾結(jié)束后移至液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀內(nèi)進(jìn)行測(cè)定[12]。1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件

色譜柱：Atlantis T3，150 mm×2.1 mm，3 μm；流動(dòng)相：A 為0.05%甲酸水，B 為乙腈；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧壓：5 000 V；霧化氣壓力：0.483 MPa；氣簾氣壓力：0.138 MPa；輔助加熱氣：0.379 MPa；離子源溫度：725 ℃。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立

香蕉中吡蟲啉計(jì)算公式如下：

式中：x為被測(cè)樣品中吡蟲啉含量，mg/kg。Ci為樣品內(nèi)待測(cè)組分的濃度，μg/mL。C0為空白樣品內(nèi)待測(cè)組分濃度，μg/mL。V1為樣品提取液總體積，mL；V2為過(guò)凈化柱的樣品體積，mL；V3為樣品最終定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。其中，Ci與C0是由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度主要來(lái)源

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析計(jì)算可知，香蕉中吡蟲啉測(cè)定的不確定度來(lái)源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合和重復(fù)性測(cè)量。

2.2 不確定度評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

（1）由吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。根據(jù)吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品證書提供信息，吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98.00%，擴(kuò)展不確定度為0.5%，其服從正態(tài)分布。置信水平P=98%，包含因子k=2，是B 類評(píng)定，相對(duì)不確定度為：

（2）配制吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)工作液與制備系列曲線時(shí)量器校準(zhǔn)引入的不確定度。在此過(guò)程中共用A 級(jí)10 mL容量瓶9 個(gè)，A 級(jí)1 mL 吸量管6 個(gè)，A 級(jí)5 mL 吸量管4 個(gè)，B 級(jí)2 mL 吸量管1 個(gè)，A 級(jí)100 mL 容量瓶2 個(gè)。玻璃量均具有一定的最大允差，按矩形分布規(guī)律估算其相對(duì)不確定度，結(jié)果如表1 所示[16]。由玻璃量具校準(zhǔn)引入的相對(duì)不確定度為：

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中量具校準(zhǔn)引入的不確定度

2.2.2 樣品前處理引入的不確定度

（1）樣品稱量引入的不確定度。樣品稱樣量為20.00 g。查閱相關(guān)權(quán)威資料，得到質(zhì)量允許差Δy為0.05 g，其置信水平P為99%?？紤]為正態(tài)分布，包含因子k=2[17]。樣品稱量引入的不確定度為：

樣品稱量引入的相對(duì)不確定度為：

（2）樣品前處理量取溶液引入的不確定度。對(duì)樣品進(jìn)行前處理使用的玻璃量器包括50 mL 的量出式量筒1 個(gè)、1 mL 的A 級(jí)單標(biāo)吸量管1 個(gè)。查閱相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)可知50 mL 量筒（量出式）容量允差為0.5 mL，1 mL 單 標(biāo) 吸 量 管（A 級(jí)）容 量 允 差 為0.040 mL，經(jīng)過(guò)計(jì)算后引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度值分別為0.072 1、0.004 62。對(duì)樣品預(yù)處理時(shí)，量取溶液的過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度為：

樣品的預(yù)處理過(guò)程中引入的不確定度為：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的線性擬合引入的不確定度

在本實(shí)驗(yàn)中采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線來(lái)校正樣品中吡蟲啉殘留量的大小。各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1 次測(cè)定，橫坐標(biāo)代表吡蟲啉濃度，縱坐標(biāo)代表峰面積，則標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是Y=19 298 200x+6 952.79，R2=0.998 8，結(jié)果如表2 所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合結(jié)果

對(duì)香蕉試樣重復(fù)測(cè)定3 次，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的吡蟲啉進(jìn)行校準(zhǔn)，可以得到x0=0.029 7，依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL006：2019）[18]可以得到由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：s為峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)；xi為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μg/mL；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；p為試樣測(cè)定次數(shù)；x0為試樣內(nèi)吡蟲啉的含量，μg/mL；x—為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值，μg/mL。

2.2.4 重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度

樣品的重復(fù)進(jìn)樣引入的不確定度屬于A 類評(píng)定，該值代表儀器的重復(fù)性是否良好，其由表3 數(shù)據(jù)計(jì)算。則由重復(fù)性測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表3 重復(fù)進(jìn)樣測(cè)量結(jié)果

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

通過(guò)計(jì)算可得，測(cè)定香蕉內(nèi)吡蟲啉含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 擴(kuò)展不確定度

擴(kuò)展不確定度U=合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度×包含因子。其中，置信度P=95%，則k=2。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

樣品內(nèi)吡蟲啉含量的最佳估計(jì)值，記作x，x=0.029 6 mg/kg，故對(duì)應(yīng)的擴(kuò)展不確定度為：

U=0.029 6×0.336 4=0.009 96 mg/kg

則香蕉中吡蟲啉測(cè)定結(jié)果為（0.029 6±0.009 96）mg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本文以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為理論依據(jù)對(duì)香蕉內(nèi)的吡蟲啉含量進(jìn)行了詳細(xì)的測(cè)定，研究了不確定度來(lái)源，分析了主要來(lái)源對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要受到標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度的影響，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制引入的不確定度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在輕微影響。因此，在檢測(cè)過(guò)程中要確保標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線配制的準(zhǔn)確性，增加標(biāo)準(zhǔn)曲線中各點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)，保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性符合規(guī)定；在儀器方面，及時(shí)做好對(duì)照品的期間核查以及儀器設(shè)備的校準(zhǔn)和檢定，為提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低誤判風(fēng)險(xiǎn)提供保障。