富貴竹過氧化物酶全長基因的克隆與表達分析

陳春花 張松 陳苗 胡漢橋 薛迎斌

摘要 [目的]克隆富貴竹全長POD 基因，檢測富貴竹感染斯氏泛菌（ Pantoea stewartii ）后該基因的表達。[方法]用PCR克隆富貴竹（ Dracaena sanderiana ）POD部分基因，用hiTAIL-PCR擴增該基因左右兩側序列。通過RT-PCR和qPCR確定POD基因在病原物侵染時的表達。[結果]獲得一個長度為3 419 bp的序列，登錄號為MZ450796。經(jīng)基因結構預測，該序列包含1個轉錄起始位點、加尾信號和4個外顯子。進化樹分析表明，該基因編碼的氨基酸序列與蘆筍POD的氨基酸序列一致性最高。接種 P.stewartii 后，POD基因的表達上調(diào)，3 d達最大值。[結論]克隆了富貴竹全長POD基因，確定了POD基因在富貴竹葉片中表達和結構預測的正確性;POD基因被 P.stewartii 誘導上調(diào)表達。

關鍵詞 富貴竹;過氧化物酶;hiTAIL-PCR;斯氏泛菌

中圖分類號 Q943.2? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）11-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.023

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Molecular Cloning and Expression Patterns of Full-length Peroxidases Gene from ?Dracaena sanderiana

CHEN Chun-hua1， ZHANG Song1， CHEN Miao1，2 et al

（1.College of Coastal Agricultural Sciences of Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088;2. South China Branch of National Saline-Alkali Tolerant Rice Technology Innovation Center， Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract [Objective]Peroxidase （POD） plays an important role in the resistance of plant disease. The full-length POD gene was cloned and the expression of the gene was determined after ?Dracaena sanderiana ?was infected by ?Pantoea stewartii . [Method]The partial POD gene of ?D. sanderiana ?was cloned by PCR. HiTAIL-PCR was used to amplify the left and right parts of the POD gene. The expression of the gene was determined by RT-PCR and qPCR. [Result]A 3 419 bp sequence was obtained， the accession number was MZ450796. The sequence contained a transcription start site， a polyadenylation signal and four exons after the gene structure prediction. Phylogenetic tree analysis showed that the amino acid sequence encoded by this gene had the highest identity with that of ?Asparagus officinalis ?POD. The expression of the POD gene of ?D. sanderiana ?was up-regulated by ?P. stewartia ?and reached the maximum after 3 days. [Conclusion]The full-length POD gene is obtained. The POD gene expresses in the leaf of ?D. sanderiana ?and the predicted gene structure is correct. The expression of the POD gene of ?D. sanderiana ?was induced by ?P. stewartia.

Key words ?Dracaena sanderiana ;Peroxidase;hiTAIL-PCR; Pantoea stewartii

植物在生長過程中難免會遭遇病蟲害、干旱、鹽漬、機械損傷、高溫、低溫等逆境脅迫。生物或非生物脅迫會使植物產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，活性氧的過量積累會對植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA與脂質(zhì)等造成氧化，從而破壞其生物膜的結構和功能，對植物造成一定的傷害[1-2]。過氧化物酶（peroxidase，POD）屬于一個超家族包含3種不同類型的POD：細胞內(nèi)I類、真菌釋放的Ⅱ類和分泌的Ⅲ類植物POD[3]。最常見的是Ⅲ類分泌型POD，其生物學功能是一種很好的活性氧清除劑，參與多種不同的生理功能，如細胞壁的合成、組織愈傷和生長素的合成與代謝等，以提高植物的抗逆性等[4-6]。POD活性與植物對細菌的抗病性具有相關性[7-9]。目前已從多種作物中克隆了POD基因，如水稻[10]、芋頭[11]、甘蔗[12]、棉花[13]和煙草[14]等。B38838FF-7371-4061-8A06-23ACEAFF21C7

富貴竹（ Dracaena sanderiana ?Sander），龍舌蘭科，龍血樹屬，是常見常綠小喬木觀賞植物，是湛江重要的花卉出口產(chǎn)品之一[15-16]。富貴竹葉片枯萎病是由斯氏泛菌產(chǎn)吲哚亞種（ Pantoea stewartii ?subsp.Indologenes）引起的一種嚴重病害[16]。由于POD在植物抗病蟲害、抗逆過程中起著重要作用，因此有必要對富貴竹POD基因展開相關研究。然而，有關克隆富貴竹POD基因鮮見報道。CODEHOP（consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primer）可以根據(jù)近緣物種基因保守的氨基酸序列，并根據(jù)物種的密碼子使用頻率在線設計簡并引物，再用PCR方法克隆未知基因[17-18]，然而利用簡并引物只能獲得基因部分序列。高效熱不對稱交錯PCR（high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR，hiTAIL-PCR），可用于擴增已知序列兩側的未知序列[19]。因此，將CODEHOP和HiTAIL-PCR結合起來，就能克隆出全長的未知基因，為研究基因的功能奠定基礎。筆者通過設計簡并引物，利用PCR及hiTAIL-PCR技術，克隆富貴竹POD基因的全長序列，并用生物信息學分析該基因的序列特征，利用RT-PCR檢測POD基因在富貴竹葉片中的表達特性，以期揭示該基因在葉片中的調(diào)控作用，為富貴竹的抗病研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

田間種植富貴竹，取新鮮嫩葉。用CTAB法提取基因組DNA;富貴竹種植于試驗盆中，生長到5～7葉期時，按Zhang等[16]方法接種病原物斯氏泛菌（ P.stewartii ），接種后1、2、3、4和5 d分別取每株富貴竹上最嫩葉片，立即置于液氮中，于-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜谔崛NA。

1.2 方法

1.2.1 POD 全長基因的克隆。

利用POD基因的簡并引物icode-POD-A2和icode-POD-C16（表1）[11]，從富貴竹基因組DNA中擴增目標基因，克隆到pMD-18T載體（TaKaRa公司）上，測序后得到POD基因的部分序列。根據(jù)POD基因部分序列，設計反向引物POD-0a、POD-1a和POD-2a以及POD-0b、POD-1b和POD-2b，采用hiTAIL-PCR技術分別擴增富貴竹POD基因兩側的DNA。所用的引物見表1。將兩側的DNA分別克隆到pMD-18T載體（TaKaRa公司）上，測序后得到POD基因的兩側序列，經(jīng)拼接后得到POD基因的全長序列。

1.2.2 基因序列的生物信息學分析。

用DNAstar軟件對所克隆的基因片段進行拼接，獲得了全長POD基因，用NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站進行Blast分析。在Softberry（http：//www.softberry.com/）中選擇植物基因組基因預測軟件，并選擇單子葉植物作為參考基因組，預測基因的結構。利用NCBI中BLASTP工具查找POD同源蛋白氨基酸序列，利用Mega 6.0軟件對不同生物的POD同源基因編碼氨基酸序列進行多重序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 RNA的分離及RT-PCR分析。

用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa）提取總RNA。用PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Takara）進行RT-PCR檢測。POD-2F、POD-3R和POD-3F、POD-4R引物用于POD基因檢測在葉片中的表達及預測基因結構是否正確。用SYBR Premix Ex TaqTM II kit（Takara）進行基因的熒光定量分析POD基因在病原物感染后表達情況。18S rRNAF和18S rRNAR作為qPCR的參考基因[20]，POD-3F和POD-4R用作檢測POD基因的表達量，RT-PCR及qPCR所用的引物見表1。采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[21]，重復3次。POD基因表達的差異性檢驗使用最小顯著差異LSD（ P <0.05）。

2 結果與分析

2.1 POD 全長基因的克隆

利用簡并引物icode-POD-A2和icode-POD-C16從富貴竹的基因組中擴增出約1 500 bp的產(chǎn)物。克隆到載體后，得到1 501 bp的序列。將基因的核苷酸序列進行Blast同源性分析，結果表明：在2%覆蓋率下，與大麥POD基因的核苷酸序列有97.22%的一致性;在15%的覆蓋率下，與短柄草POD基因的核苷酸序列有71.79%的一致性。說明克隆到的序列為富貴竹的POD基因，但與其他物種的POD基因序列差異較大。為了克隆出富貴竹POD基因的全長序列，利用基因的部分序列設計hiTail-PCR引物，擴增該基因的左右兩側DNA。POD-0b與LAD1-1和LAD1-4引物的組合進行預擴增，擴增出拖帶DNA，其間有弱的DNA條帶（圖1A）。將預擴增產(chǎn)物稀釋后作為模板，用POD-1b引物分別與AC1引物進行初級擴增，經(jīng)檢測后均出現(xiàn)條帶;將初級擴增產(chǎn)物稀釋后作為模板，用POD-2b和引物AC1進行次級擴增，經(jīng)檢測后出現(xiàn)特異性條帶。POD-2b擴增產(chǎn)物的大小比POD-1b擴增的條帶小，與預期設計引物的結果相符合（圖1B）。將圖1B中3和5的次級擴增產(chǎn)物分別克隆到T載體中，篩選陽性菌，提取重組質(zhì)粒測序。POD基因的序列能與簡并引物擴增基因的序列拼接到一起，說明克隆出POD基因的一側基因。同樣用POD-0a、POD-1a和POD-2a成功地克隆了基因另一側，所獲得的序列與簡并引物擴增基因的序列拼接到一起，經(jīng)拼接后得到一個長度為3 419 bp的序列。經(jīng)Blast同源性分析，在覆蓋率5%的情況下，該全長基因與蘆筍的POD基因序列一致性為79.80%，表明該序列為POD基因。B38838FF-7371-4061-8A06-23ACEAFF21C7

在softberry 網(wǎng)站上選擇玉米作為參考基因序列，進行基因結構預測，預測的基因結構如圖2所示。該基因包括 4 個外顯子，分別位于 788～985、1 200～1 391、1 474～1 639和2 128～2 519 bp處。該基因在371 bp處有一個轉錄起始位點（transcriptional start site，TSS），在2 450 bp處有加尾信號（polyA）。因此，該序列包括一個完整的啟動子和加尾信號，是一個全長基因，接收號為MZ450796。

用該基因的氨基酸序列進行Blast搜索，獲得與該基因同源的其他植物蛋白氨基酸序列，用Mega 6.0軟件構建進化樹，結果見圖3。該基因的氨基酸與蘆筍POD的氨基酸序列同源性最高，聚為一類。在覆蓋率100%時，蘆筍POD氨基酸序列的一致性為74.30%，進一步證明拼接后的序列為富貴竹POD基因。說明成功克隆出富貴竹POD的全長基因。

2.2 POD 基因的表達

根據(jù)預測的基因結構，引物POD-2F和POD-3R預計從基因組中擴增387 bp的片段，從cDNA中擴增305 bp片段;引物POD-3F和POD-4R預計從基因組中擴增679 bp的片段，從cDNA中擴增191 bp片段。用RT-PCR檢測基因在葉片中的表達，結果見圖4。從圖4可以看出，第2、3泳道的產(chǎn)物與預期的191 bp和679 bp相近，第4、5泳道的產(chǎn)物與預期的305 bp和387 bp相近。RT-PCR中擴增的產(chǎn)物都有一條帶的大小與基因組擴增的大小相近，其原因是提取RNA后，沒有用DNA酶降解RNA中基因組DNA。結果表明，POD基因在葉片中表達且克隆出的全長基因預測結構是正確的。

根據(jù)RT-PCR的結果，選擇從cDNA中擴增大小為191 bp的POD-3F和POD-4R進行熒光定量PCR。提取接種后1、2、3、4和5 d富貴竹嫩葉的RNA，用無RNA酶的DNA酶降解RNA中殘留的基因組DNA后，用18S rRNA作參照基因進行qPCR，結果見圖5。從圖5可以看出，POD基因的表達在接種 P.stewartii 后表達量上升，到接種3 d，其相對表達量達最大值6.63，之后POD基因的表達開始下降。因此，POD基因的表達受病原物誘導表達。

3 討論

過氧化物酶（POD）在植物正常生長和應激反應中發(fā)揮著重要作用，是植物重要的保護酶類，在高等植物中分布較為廣泛。因此，克隆植物POD基因并研究其功能具有重要意義。當前隨著三代測序技術的發(fā)展，可以迅速完成對植物基因組的高深度測序，從而獲得該物種大量的基因序列[22]，但植物基因組測序仍存在倍性和雜合度的挑戰(zhàn)，且成本較高。因此，從植物基因組中克隆出基因仍具有廣泛的應用前景，且目前在許多植物中已經(jīng)克隆到POD基因的報道。其中有根據(jù)物種已有POD基因的序列，設計特異性引物擴增基因或基因的cDNA[12，14，23-24]。然而目前尚缺乏富貴竹POD基因序列。在芋頭中，在沒有基因序列的情況下，利用CODEHOP設計簡并引物擴增了POD基因，并用HiTAIL-PCR獲得芋頭POD部分基因[11]。該研究利用POD基因簡并引物從富貴竹中擴增出POD的部分基因，利用hiTAIL-PCR技術成功克隆出該基因的側翼序列，成功克隆出包含全部啟動子和加尾信號的POD全長基因。

用RT-PCR方法定性地證實了POD基因在葉片中表達。葉片在植物的抗病蟲、抗逆過程中具有重要功能，因此POD基因在葉片中的表達可能在這些過程中起著重要作用。在RT-PCR中，由于在提取RNA時經(jīng)常有DNA的污染。在不同的外顯子上設計引物，并用基因組擴增產(chǎn)物作對照，擴增產(chǎn)物與基因組的擴增產(chǎn)物大小，與預期從cDNA上擴增產(chǎn)物大小一致。一方面證實了RT-PCR的產(chǎn)物是來自cDNA，是基因表達的真實產(chǎn)物，同時也證實了預測POD基因結構的準確性。水稻的4個POD基因，只有2個被黃單孢桿菌誘導表達，接種12～24 h表達量達最大，然后逐漸下降[7]。 甜橙的12個POD基因，在感病品種被黃單孢桿菌感染后，2個POD表達上升，接種48 h表達量達到最大值，然后逐漸下降[9]。從富貴竹中克隆的POD基因接種 P.stewartii 后表達量上升，3 d時相對表達量達最大值，然而之后逐漸下降，說明該POD基因被病原物誘導表達，可能與富貴竹的抗病性有關。

4 結論

通過簡并引物擴增并克隆了富貴竹 POD 部分基因，利用已克隆的 POD 基因部分序列設計 hiTAIL-PCR 引物擴增該基因左右兩側DNA，最終獲得一個長度為 3 419 bp 的序列。經(jīng)基因結構預測，該序列包含 1 個轉錄起始位點、加尾信號和 4 個外顯子。該基因編碼的氨基酸序列與蘆筍 POD 的氨基酸序列一致性最高，獲得了 POD 全長基因。通過 RT-PCR 確定了 POD 基因在富貴竹葉片中表達，并確定了基因結構預測的正確性。qPCR 結果表明，POD 基因被 P.stewartii 誘導上調(diào)表達。

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