PRLR 基因InDel檢測(cè)及其與陜北白絨山羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

王聰亮 張政軒 付琪 魏宇新 白晶晶 宋曉越 李隴平 屈雷 朱海鯨

摘要 [目的]探究催乳素受體（prolactin receptor，PRLR）基因InDel突變對(duì)絨山羊種群生長(zhǎng)特性的影響。[方法]以陜北白絨山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)法檢測(cè)分析陜北白絨山羊 PRLR 基因的多態(tài)性，利用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)和單因素方差法分析 PRLR基因 不同基因型與陜北白絨山羊生長(zhǎng)性狀之間的相關(guān)性。[結(jié)果]在所檢測(cè)的1 176只陜北白絨山羊群體中， PRLR 基因第2內(nèi)含子存在1個(gè)16 bp InDel突變，形成了純合插入型（II）、雜合型（ID）與純合缺失型（DD）3種基因型;在育成羊群體中，該InDel突變與生長(zhǎng)性狀無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（ P >0.05），在成年羊群體中，InDel突變與管圍性狀顯著相關(guān)（ P< 0.05）;在育成羊和成年羊全部群體中，InDel突變?nèi)耘c管圍性狀顯著相關(guān)（ P< 0.05）。[結(jié)論] PRLR 基因16 bp InDel突變可能會(huì)對(duì)陜北白絨山羊生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生顯著影響，該位點(diǎn)可作為陜北白絨山羊輔助育種的候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 絨山羊;PRLR基因;InDel;生長(zhǎng)性狀;關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào) S827? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）11-0085-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.022

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

InDel Detection of ?PRLR ?Gene and Its Association Analysis with Growth Traits of Shanbei White Cashmere Goats

WANG Cong-liang，ZHANG Zheng-xuan，F(xiàn)U Qi et al

（Shaanxi Province Engineering & Technology Research Center of Cashmere Goats，Yulin University，Yulin，Shaanxi 719000）

Abstract [Objective]In order to investigate the effect of prolactin receptor（PRLR） gene InDel mutation on the growth characteristics of cashmere goat population.[Method]The Shanbei white cashmere goats were used as the research object，and used PCR amplification and direct sequencing techniques to detect the polymorphism of ?PRLR ?gene in Shanbei white cashmere goats，and analyzed the correlation between different genotypes of ?PRLR ?gene and growth traits of Shanbei white cashmere goats using independent sample ?t -test and one-way ANOVA.[Result]The results showed that there was one 16 bp InDel mutation in intron 2 of the ?PRLR ?gene in the 1 176 Shanbei white cashmere goats population，and there were three genotypes：homozygous insertion type（II），heterozygous type（ID） and homozygous deletion type（DD），respectively.The InDel mutation was not significantly correlated with growth traits in the yearling goats population（ P >0.05），and was significantly correlated with the cannon circumference trait in the adult goats population（ P< 0.05）;In all of the goat population this InDel mutation was still significantly correlated with the cannon circumference trait（ P< 0.05）.[Conclusion]The 16 bp InDel mutation in ?PRLR ?gene may impose significant effect on the growth and development of Shanbei white cashmere goats，and this locus can be used as a candidate molecular marker for the auxiliary breeding of high-yielding Shanbei white cashmere goats.

Key words Cashmere goats; PRLR ?gene;InDel;Growth traits;Association analysisB38838FF-7371-4061-8A06-23ACEAFF21C7

催乳素（Prolactin，PRL）主要是垂體前葉分泌的一種肽類激素[1]，僅包含1個(gè)跨膜區(qū)域的膜結(jié)合蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于乳腺、卵巢、睪丸等組織，PRL通過(guò)與其受體（PRLR）結(jié)合作用于靶器官，參與調(diào)控乳腺發(fā)育、黃體生成、調(diào)節(jié)滲透壓等及繁殖相關(guān)激素分泌等多種生理活動(dòng)[2-3]。按照PRLR受體胞內(nèi)域氨基酸數(shù)目和胞質(zhì)區(qū)域組成可分為長(zhǎng)型PRLR、中型PRLR和短型PRLR，其功能各不相同[4]。據(jù)報(bào)道，PRL在大鼠、綿羊和牛等多個(gè)物種內(nèi)分布廣泛，通過(guò)與不同PRLR受體亞型結(jié)合介導(dǎo)，作用于相應(yīng)靶細(xì)胞質(zhì)膜，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用[5-6]。

PRLR 基因作為泌乳相關(guān)基因，研究人員發(fā)現(xiàn)， PRLR基 因與母豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)，可作為豬高產(chǎn)仔數(shù)性狀的候選基因[7]，國(guó)內(nèi)外研究人員就 PRLR 基因?qū)π笄菝谌楹头敝承誀畹挠绊懻归_大量研究。如， PRLR 基因側(cè)翼區(qū)一處SNP突變與疆岳驢平均日泌乳量和乳蛋白率顯著相關(guān)，可作為乳用型疆岳驢選育的有效DNA標(biāo)記[8]。此外， PRLR基因 也可作為高產(chǎn)仔數(shù)和海門山羊選育的重要候選基因[9-10]。但 PRLR 基因多態(tài)并不是都與動(dòng)物繁殖相關(guān)，如 PRLR基 因多個(gè)SNP突變位點(diǎn)與湖羊和濟(jì)寧青山羊等數(shù)個(gè)品種的產(chǎn)羔性狀無(wú)顯著關(guān)聯(lián)[11-12]。陜北白絨山羊作為優(yōu)秀絨肉兼用品種，目前關(guān)于 PRLR基 因與陜北白絨山羊生產(chǎn)相關(guān)性狀的研究較少[13]。為此，筆者采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)探究 PRLR 基因InDel多態(tài)性及其與不同陜北白絨山羊群體生產(chǎn)性狀的相關(guān)性，以期為絨山羊的高效選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與基因組DNA

試驗(yàn)羊由陜西應(yīng)馬安絨山羊養(yǎng)殖公司提供，包括618只育成羊（1.0～1.5歲）和558只成年羊（1.5～4.0歲），均為雌性。剪取試驗(yàn)羊耳尖部約0.4 cm2耳組織儲(chǔ)存在含有70 %乙醇的1.5 mL Eppedorff管中，同時(shí)測(cè)量試驗(yàn)羊體重、體高、體長(zhǎng)、胸圍、髖寬、管圍、十字部高、胸深、胸寬、絨細(xì)度10個(gè)性狀數(shù)據(jù)[14]。同時(shí)提取試驗(yàn)羊耳組織DNA[15]，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 瓊脂糖、Marker 1和PCR Master Mix，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;EB核酸染料，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 ?PRLR 基因InDel目的片段的PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[13]，選取 PRLR 基因第2內(nèi)含子16 bp InDel突變位點(diǎn)（NC_030827.1.g.61200-61206，61209-61214，61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG）作為候選變異位點(diǎn)，并利用文獻(xiàn)中的引物對(duì)候選變異位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。 PRLR 基因的PCR擴(kuò)增體系：PCR Master Mix 6.5 μL，上下游引物各0.3 μL，模板DNA 0.7 μL，ddH2O補(bǔ)至13 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共38個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)保存，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度分別為143 bp和127 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳并鑒定分型，引物合成與PCR產(chǎn)物測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Microsoft Excel 2018軟件計(jì)算 PRLR 基因InDel突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，使用Nei方法計(jì)算基因純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）等群體遺傳學(xué)參數(shù)，使用在線平臺(tái)SHEsis（https：//analysis.bio-x.cn）計(jì)算 PRLR 基因多態(tài)性是否處于哈代溫伯格（HWE）平衡[16]。其生物統(tǒng)計(jì)模型為 Yijk=μ+Gi+Eij，其中μ為總體平均值，Gi為基因型固定效應(yīng)，Eij 為隨機(jī)誤差。利用SPSS 23.0軟件，分別運(yùn)用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)和單因素方差方法完成 PRLR基 因陜北白絨山羊育成羊和成年羊群體不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析;再利用Microsoft Excel 2018軟件計(jì)算不同群體各個(gè)性狀表型值的

平均值，用個(gè)體表型值減去平均值得到差值，運(yùn)用單因素方

差方法分析不同基因型與陜北白絨山羊群體生長(zhǎng)性狀之間的差異顯著性，其中育成羊和成年羊?yàn)橐粋€(gè)整體，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?PRLR 基因InDel檢測(cè)與分型 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。陜北白絨山羊 PRLR 基因16 bp InDel位點(diǎn)（NC_030827.1.g.61200-61206，61209-61214，61298-61300 del GAGGGC-GGGAGGG-AAG）具有多態(tài)性，分別產(chǎn)生了純合插入型（II，143 bp）、雜合型（ID，143 bp和127 bp）與純合缺失型（DD，127 bp）3種基因型，產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2，測(cè)序結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果一致。

2.2 ?PRLR 基因遺傳多樣性 ?PRLR 基因16 bp InDel突變位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)性信息含量（PIC）等群體遺傳學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果顯示， PRLR 基因16 bp InDel突變位點(diǎn)在陜北白絨山羊育成羊、成年羊和全部群體中均屬于低度多態(tài)（PIC<0.25），I型等位基因頻率均高于D型;該突變位點(diǎn)在成年羊群體處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（ P >0.05），但在育成羊和全部群體中偏離了哈代溫伯格平衡（ P< 0.05）。

2.3 不同陜北白絨山羊群體 PRLR 基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析B38838FF-7371-4061-8A06-23ACEAFF21C7

通過(guò)SPSS 23.0軟件對(duì) PRLR 基因InDel位點(diǎn)多態(tài)性與不同陜北白絨山羊群體生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2～4。在陜北白絨山羊育成羊群體中 （n =618），由于體重和絨細(xì)度性狀DD基因型只有2個(gè)樣本，故運(yùn)用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)法對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示不同基因型與生長(zhǎng)性狀均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（表2）;在成年羊群體中 （n =558），ID基因型山羊的管圍顯著高于II基因型（ P< 0.05）（表3）;在育成羊和成年羊全部群體中（ n =1 176），ID基因型山羊的管圍仍顯著高于II基因型（ P< 0.05），優(yōu)勢(shì)基因型與成年羊群體相同，均為ID型（表4）。

3 討論

陜北白絨山羊作為國(guó)內(nèi)知名絨肉兼用山羊品種，其中陜北地區(qū)是重要養(yǎng)殖區(qū)域，產(chǎn)肉性能及遺傳穩(wěn)定性差等是養(yǎng)殖過(guò)程中的主要問(wèn)題[17]。相對(duì)傳統(tǒng)育種方法而言，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)（MAS）具有選擇準(zhǔn)確度高、育種周期短等優(yōu)勢(shì)[18]，目前已廣泛應(yīng)用于家畜育種，用于改良家畜經(jīng)濟(jì)性狀，提高生產(chǎn)性能[19-20]。

多態(tài)信息含量等與基因遺傳多樣性往往具有直接關(guān)系[21]。該突變多態(tài)信息含量顯示，在陜北白絨山羊不同群體中均屬于低度多態(tài)水平（PIC<0.25），說(shuō)明群體遺傳變異較小，可適當(dāng)加強(qiáng)選擇強(qiáng)度，但在育成羊和全部群體中偏離了哈代溫伯格平衡（ P< 0.05），說(shuō)明可能受到遺傳漂變及人工選育的影響，而陜北白絨山羊正是人工選育與雜交形成的新品種，等位基因流失可能是其主要影響因素[22]。將 PRLR 基因16 bp InDel突變位點(diǎn)多態(tài)性與陜北白絨山羊的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，該突變位點(diǎn)與陜北白絨山羊育成羊生長(zhǎng)性狀無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，但與成年羊管圍性狀顯著相關(guān);當(dāng)把育成羊和成年羊作為一個(gè)群體分析時(shí)，該InDel突變位點(diǎn)仍與管圍性狀顯著相關(guān)，優(yōu)勢(shì)基因型與成年羊群體相同，均為ID型，具有很好的一致性。在成年羊群體中，該突變位點(diǎn)能顯著影響山羊的管圍性狀，但對(duì)育成羊生長(zhǎng)性狀無(wú)顯著影響，推測(cè)可能存在以下原因：①生長(zhǎng)發(fā)育階段不同，育成羊尚未發(fā)育完善;② PRLR 基因表達(dá)存在時(shí)序性，如 PRLR 基因在牦牛生長(zhǎng)發(fā)育后期睪丸組織中的表達(dá)量極顯著高于前期[23]，同時(shí)5日齡與8周齡雌性大鼠肝臟組織中 PRLR 基因表達(dá)量有較大差異[24]，故 PRLR 基因可能在陜北白絨山羊不同生長(zhǎng)發(fā)育階段存在差異表達(dá)。同時(shí)研究顯示[25]，羊體質(zhì)量與管圍性狀存在顯著關(guān)聯(lián)，表明 PRLR 基因該突變位點(diǎn)可能會(huì)間接影響陜北白絨山羊體重性狀，其中具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。

有報(bào)道稱， PRLR 基因分別定位于綿羊、山羊的16、20號(hào)染色體[26-27]，其中在綿羊腹股溝竇、脂肪和山羊肌肉、肝臟及皮下脂肪中存在不同程度的 PRLR 基因表達(dá)[28-29]。目前研究人員普遍認(rèn)為 PRLR 主要通過(guò)JAK2-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與機(jī)體調(diào)控，通過(guò)JAK2酪氨酸激酶的活化對(duì)STAT5轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化，從而形成同型二聚體，與靶基因啟動(dòng)子上的γ-干擾素激活位點(diǎn)序列特異性結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)并調(diào)控蛋白表達(dá)[20-31]，除此之外，有絲分裂原激活蛋白（MAP）激酶途徑也被認(rèn)為是參與介導(dǎo)PRL調(diào)控作用的重要途徑[32]。研究顯示，催乳素合成分泌與下丘腦多巴胺的調(diào)控有直接關(guān)系，多巴胺與催乳素細(xì)胞表面的多巴胺D2特異性結(jié)合，在小鼠中，缺乏多巴胺D2R受體亞型與其體重增加有直接關(guān)系[33]，小鼠敲除 PRLR 基因后骨形成速率和骨密度較敲除前有所下降[34]。研究證實(shí)， PRLR 在調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[35]，在刺激NIH3T3細(xì)胞快速增殖的同時(shí)還能有效促進(jìn)細(xì)胞分裂蛋白激酶的激活[36]。同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)， PRLR在 牦牛等動(dòng)物肝臟、骨骼肌和腎臟均有較高表達(dá)水平[23，37]，并 且PRLR 基因p.H406R和p.M480T 2個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)多態(tài)與大白豬背部脂肪有顯著影響[38]，說(shuō) 明PRLR 基因可能參與早期動(dòng)物胚胎及機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。

綜上所述， PRLR 基因16 bp InDel突變對(duì)陜北白絨山羊管圍性狀有顯著影響，可作為陜北白絨山羊優(yōu)良生長(zhǎng)性狀選育的重要候選基因。

4 結(jié)論

該研究驗(yàn)證了 PRLR 基因在陜北白絨山羊群體中存在1個(gè)16 bp的插入缺失，并發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)對(duì)陜北白絨山羊群體部分生長(zhǎng)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)，提示該位點(diǎn)可作為陜北白絨山羊分子標(biāo)記輔助育種的有效DNA標(biāo)記。

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