小鼠不同脂肪組織對(duì)冷應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)

耿 蓉，羅 巖，孫 翠，向李倩，劉 煜

南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 211166

肥胖已成為全球公共衛(wèi)生危機(jī)，中國(guó)是全球受肥胖影響人數(shù)最多的國(guó)家之一，約46%的成年人和15%的兒童肥胖或超重［1-2］。脂肪組織是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡中重要的靶器官，不僅能夠通過(guò)能量貯存和釋放，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)產(chǎn)熱、改變局部炎癥狀態(tài)來(lái)參與機(jī)體能量代謝平衡［3］。冷刺激治療肥胖的潛在作用包括誘導(dǎo)脂肪組織適應(yīng)性產(chǎn)熱［4］、促進(jìn)2 型免疫、促進(jìn)脂肪分解［5］等。

脂肪組織分為以下3 種類(lèi)型：棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）、白色脂肪組織（主要是附睪白色脂肪，epididymal white adipose tissue，eWAT）和米色脂肪組織（主要是腹股溝脂肪組織，inguinal white adipose tissue，iWAT）［6］。BAT 主要由棕色脂肪細(xì)胞組成，含有豐富的血管和高度神經(jīng)支配，是機(jī)體非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的主要器官［7］；eWAT 的主要功能是儲(chǔ)存和釋放能量，血管和神經(jīng)分布最少；iWAT 在腹股溝區(qū)較為明顯，交感神經(jīng)纖維相對(duì)BAT 較少［8］。iWAT 中除脂肪細(xì)胞外還存在一些免疫細(xì)胞，比如嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等［9］。iWAT響應(yīng)寒冷和其他某些刺激而出現(xiàn)適應(yīng)性改變，稱(chēng)為適應(yīng)性產(chǎn)熱［6，10］，這一過(guò)程伴隨著神經(jīng)重塑［11］。在肥胖個(gè)體中，脂肪組織呈現(xiàn)出慢性、低度炎癥的狀態(tài)，其中巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出促炎性M1型極化的狀態(tài)［12］。冷刺激后iWAT 中嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞被選擇性激活，選擇性激活的巨噬細(xì)胞可以通過(guò)分泌兒茶酚胺增加脂解、促進(jìn)適應(yīng)性產(chǎn)熱［13］。與BAT 相比，iWAT 具有更大的表型靈活性，可以根據(jù)外界環(huán)境調(diào)整產(chǎn)熱或脂質(zhì)儲(chǔ)存表型。BAT和iWAT能夠增加能量消耗、促進(jìn)產(chǎn)熱，有益于探究肥胖及其相關(guān)代謝綜合征的治療。

本研究通過(guò)觀察C57BL∕6J小鼠3種脂肪組織對(duì)冷刺激響應(yīng)的區(qū)別，為研究冷刺激條件下脂肪組織功能及作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

10 周齡雄性C57BL∕6J 小鼠購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重24～28 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、使用和操作均獲得南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)為IACUC?1901036）。蛋白marker（ThermoFisher 公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），SYBR Green（上海翌圣生物科技股份有限公司），引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和處理

將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，待小鼠體征穩(wěn)定后隨機(jī)分為2 組：對(duì)照組和冷刺激組。對(duì)照組小鼠喂養(yǎng)于室溫（22 ℃）環(huán)境；冷刺激組小鼠于6 ℃環(huán)境飼養(yǎng)，兩組均單籠單只。

1.2.2 RNA提取及相對(duì)定量分析

取20～30 mg 小鼠脂肪組織，加500 μL RNA?easy Isolation Reagent 在高速組織研磨儀中研磨，70 Hz，120～180 s，按說(shuō)明書(shū)抽提RNA，OneDrop 微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量及純度分析。

用5×HiScript ⅡqRT Super Mix逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。

用去離子水10 倍稀釋cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照稀釋后的cDNA 4.6 μL，SYBR Green 5 μL，上、下游引物（10 mmol∕L）各0.2 μL，混勻，反應(yīng)在ThermoFisher Quant Studio5熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線(xiàn)：95 ℃15 s；60 ℃1 min，95 ℃15 s。以2-ΔΔCT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

目的基因和內(nèi)參引物如下：解偶聯(lián)蛋白1（un?coupling protein 1，Ucp?1）上游引物5′?AGGCTTC?CAGTACCATTAGGT?3′，下游引物5′?CTGAGTGAG?GCAAAGCTGATTT?3′；細(xì)胞死亡誘導(dǎo)DNA 片段化因子樣效應(yīng)子A（cell death inducing DFFA like effec?tor A，Cidea）上游引物5′?TGCTCTTCTGTATCGCC?CAGT?3′，下游引物5′?GCCGTGTTAAGGAATCT?GCTG?3′；過(guò)氧化物酶體增殖受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator?activated receptor gamma co?activator 1?α，Ppargc1α）上游引物5′?AGCCGTGAC?CACTGACAACGAG?3′，下游引物5′?GCTGCATG?GTTCTGAGTGCTAAG?3′；內(nèi)參基因β?actin上游引物5′?GTTGGTTGGAGCAAACATC?3′，下游引物5′?CTTATTTCATGGATACTTGGAATG?3′。

1.2.3 Western blot

各脂肪組織加裂解液后勻漿，冰上充分裂解后，4 ℃12 000g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新FP 管中。加入5×SDS上樣緩沖液，變性后電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，一抗過(guò)夜，孵育二抗，F(xiàn)CL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)

脂肪組織用消化酶消化，細(xì)胞過(guò)篩，離心后重懸1 次，再次離心，F(xiàn)c 受體封閉液封閉，加入相應(yīng)抗體anti?CD45?PF∕Cy7、anti?CD11b?PerCP∕Cy5.5、anti?F4∕80?AF488、anti?CD11c?APC，孵育30 min。流式細(xì)胞染色緩沖液洗滌，細(xì)胞活性染料染色。離心去染料，重懸細(xì)胞，加入固定劑，室溫下避光孵育。洗滌后離心棄上清，重懸細(xì)胞。加入破膜劑和anti?CD206?PF，避光孵育后洗滌，離心棄上清，再渦旋使細(xì)胞完全重懸，用0.1%甲醛固定，2～8 ℃避光保存，并在24 h內(nèi)對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用Fxcel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）進(jìn)行描述，兩組定量數(shù)據(jù)比較采用雙尾t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冷刺激增加進(jìn)食量，對(duì)體重及脂肪組織重量影響不顯著

C57BL∕6J 小鼠冷刺激實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1A 所示，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)24 h后，分別記錄對(duì)照組和冷刺激組小鼠體重、血糖、原始食物量，冷刺激組小鼠6 ℃、單籠單只飼養(yǎng)；冷刺激48 h 后，記錄對(duì)照組和冷刺激組小鼠體重、血糖、食物余量；冷刺激70 h 后，安樂(lè)死小鼠，分別取肩胛區(qū)BAT、腹股溝區(qū)iWAT、附睪eWAT。

冷刺激48 h，對(duì)照組和冷刺激組體重（圖1B）、脂肪組織及肝臟重量（圖1C）無(wú)顯著差異。冷刺激組小鼠進(jìn)食量顯著增加（P=0.006 8，n=5，圖1D），這與其他文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［14］。觀察各脂肪組織切片的HF 染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，冷刺激組BAT 中細(xì)胞大小及胞內(nèi)脂滴無(wú)明顯變化，iWAT 組織內(nèi)呈現(xiàn)褐色化改變，eWAT 內(nèi)脂肪細(xì)胞體積略減少（圖1F），說(shuō)明冷刺激顯著誘導(dǎo)iWAT褐色化。

圖1 冷刺激后小鼠體重及脂肪組織的變化Figure 1 Changes of body weight and adipose tissues in mice after cold stimulation

2.2 冷刺激后3種脂肪組織產(chǎn)熱基因表達(dá)有所不同

為了明確冷刺激對(duì)不同脂肪組織產(chǎn)熱及線(xiàn)粒體功能是否存在不同，對(duì)不同脂肪組織進(jìn)行了Ucp?1的免疫組化染色（圖2A）。發(fā)現(xiàn)在BAT和eWAT中，對(duì)照組和冷刺激組Ucp?1 無(wú)顯著差異；而在iWAT中，冷刺激組Ucp?1 表達(dá)顯著高于對(duì)照組。通過(guò)qRT?PCR和Western blot檢測(cè)了BAT、iWAT和eWAT中不同基因mRNA和蛋白表達(dá)水平：在BAT中，qRT?PCR結(jié)果顯示冷刺激組中Ppargc1α、Cidea、腫瘤壞死因子受體超家族成員9（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9∕CD137）等褐色化相關(guān)基因和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyl?transferase 1A，Cpt1a）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2（carni?tine palmitoyltransferase 2，Cpt2）等脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（圖2B），而對(duì)照組和冷刺激組Ucp?1的mRNA和蛋白水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B、C），考慮在3種脂肪組織中，BAT中Ucp?1 表達(dá)最高，冷刺激不能引起其進(jìn)一步升高。在iWAT 中，qRT?PCR 結(jié)果顯示冷刺激組Ucp?1、Ppargc1α、Cidea 等褐色化相關(guān)基因和烏頭酸酶2（aconitase 2，Aco2）等線(xiàn)粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（圖2D）；Western blot結(jié)果顯示冷刺激組Ucp?1、CCAAT∕增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT∕en?hancer?binding protein β，C∕FBPβ）等產(chǎn)熱相關(guān)基因和激素敏感型脂肪酶（hormone?sensitive lipase，HSL）的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（圖2F），表明冷刺激能夠促進(jìn)iWAT 產(chǎn)熱和線(xiàn)粒體功能顯著增加。在eWAT中，qRT?PCR結(jié)果顯示冷刺激組Aco2、ATP 合成酶?H+轉(zhuǎn)運(yùn)?線(xiàn)粒體F1復(fù)合體α亞基1（ATP synthase，H+transporting，mitochondrial F1 complex，alpha subunit 1，Atp5α1）、琥珀酸脫氫酶B 亞基（succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B，Sdhb）等線(xiàn)粒體功能相關(guān)基因和Cpt2 的表達(dá)顯著升高（圖2F）；Western blot 結(jié)果顯示對(duì)照組和冷刺激組在產(chǎn)熱相關(guān)基因表達(dá)上無(wú)顯著差異（圖2G）。以上結(jié)果提示冷刺激提高3種脂肪組織線(xiàn)粒體的功能，但僅能提高BAT和iWAT而非eWAT中產(chǎn)熱基因的表達(dá)。

圖2 冷刺激后3種脂肪組織產(chǎn)熱基因表達(dá)水平Figure 2 Expressions of thermogenic genes in three adipose tissues after cold stimulation

2.3 冷刺激后3種脂肪組織交感神經(jīng)基因表達(dá)變化

研究表明脂肪組織產(chǎn)熱主要受交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素調(diào)節(jié)，酪氨酸羥化酶（tyrosin hydroxy?lase，TyrH）主要表達(dá)于交感神經(jīng)，是兒茶酚胺類(lèi)激素生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶。免疫組化結(jié)果顯示，在BAT 和iWAT 中，冷刺激組TyrH 表達(dá)顯著高于對(duì)照組（圖3）。

圖3 免疫組化檢測(cè)產(chǎn)熱脂肪組織TyrH表達(dá)Figure 3 TyrH expression in thermogenic adipose tissues detected by immunohistochemical staining

2.4 冷刺激后3種脂肪組織中巨噬細(xì)胞的M2型極化狀態(tài)變化

巨噬細(xì)胞極化在脂肪組織炎癥中起著重要作用。M1型巨噬細(xì)胞是經(jīng)典型巨噬細(xì)胞，具有促炎活性，其標(biāo)志物是CD11c［15］；M2 型巨噬細(xì)胞是選擇性激活的巨噬細(xì)胞，呈現(xiàn)出抗炎作用，其標(biāo)志物是CD206［15］。為了明確冷刺激對(duì)脂肪組織中巨噬細(xì)胞的影響，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞亞型。與對(duì)照組相比，冷刺激組BAT和iWAT中M1型巨噬細(xì)胞的比例有所降低（圖4A），而M2 型巨噬細(xì)胞比例顯著升高（圖4B），表明冷刺激可以改善BAT 和iWAT中的炎癥狀態(tài)。eWAT 中巨噬細(xì)胞極化改變不明顯。以上結(jié)果表明冷刺激能夠促進(jìn)BAT和iWAT中巨噬細(xì)胞M2型極化，對(duì)eWAT中巨噬細(xì)胞極化影響不大。

圖4 流式分析冷刺激后3種脂肪組織巨噬細(xì)胞Figure 4 Flow cytometric analysis of three kinds of adipose tissue macrophages after cold stimulation

3 討論

本研究旨在探討C57BL∕6J 小鼠中不同類(lèi)型的脂肪組織對(duì)冷刺激適應(yīng)性應(yīng)答的相似點(diǎn)與差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種脂肪組織對(duì)冷刺激的應(yīng)答有所不同。BAT 作為機(jī)體非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的主要組織，產(chǎn)熱基因Ucp?1表達(dá)在3種脂肪組織中最高，冷刺激不能進(jìn)一步提高其表達(dá)水平，但組織內(nèi)交感神經(jīng)支配顯著提高，巨噬細(xì)胞M2型極化增加，這可能與產(chǎn)熱少量增加有關(guān)。iWAT 對(duì)冷刺激響應(yīng)最為積極，產(chǎn)熱基因和M2 型巨噬細(xì)胞都顯著提高，組織內(nèi)交感神經(jīng)支配顯著增加。eWAT 中產(chǎn)熱基因表達(dá)和M2 型巨噬細(xì)胞比例均無(wú)明顯變化，對(duì)冷刺激響應(yīng)不顯著?？紤]冷刺激時(shí)間較短，且內(nèi)臟脂肪的主要作用是儲(chǔ)存能量，受環(huán)境溫度調(diào)控較小。冷刺激后所有脂肪組織的線(xiàn)粒體功能都有所增強(qiáng)，但脂肪組織重量和體重?zé)o顯著變化，考慮冷刺激后小鼠進(jìn)食量增加，脂肪產(chǎn)熱的增加來(lái)源于攝入食物的增加。

綜上所述，不同類(lèi)型的脂肪組織在冷刺激后，產(chǎn)熱、交感神經(jīng)支配、脂肪組織巨噬細(xì)胞極化方面均存在顯著差異，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外本研究?jī)H觀察了C57BL∕6J 小鼠冷刺激后脂肪組織的差異，未觀察肥胖小鼠冷刺激后不同脂肪組織的差異，需進(jìn)一步造模研究（ob∕ob 鼠或者高脂飲食誘導(dǎo)肥胖［16］）。不同脂肪組織對(duì)冷刺激不同響應(yīng)的研究有助于了解脂肪組織在冷刺激后機(jī)體代謝過(guò)程中的作用，且對(duì)研究肥胖與代謝綜合征等疾病的診斷、治療過(guò)程極為重要。隨著不同類(lèi)型脂肪組織差異性研究的不斷推進(jìn)，脂肪組織的代謝功能及對(duì)機(jī)體生理和病理狀態(tài)影響的了解會(huì)更加深入。