miR-9-3p在2型糖尿病患者血漿中表達水平及其對Sirt1蛋白表達的影響

孫雅楠 李斯 李潔

(唐山市工人醫(yī)院 1內分泌二科，河北 唐山 063000；2心內四科；3婦產科)

2型糖尿病(T2DM)是一種復雜的代謝性疾病，胰島素抵抗及胰島素分泌相對缺乏為其主要特點，目前研究顯示miR-9-3p在調節(jié)胰島素抵抗及調節(jié)機體胰島素分泌水平發(fā)揮重要作用〔1，2〕。國內外關于T2DM患者血漿miR-9-3p表達水平的研究較少，沉默信息調節(jié)因子(Sirt1)廣泛存在于機體組織當中，能夠促進胰島β細胞分泌胰島素、提高組織對胰島素的敏感性，參與機體能量代謝，參與DNA損傷修復等過程，起到延緩組織細胞衰老的作用〔3～6〕。目前研究顯示miR-195、miR-34a均能通過調節(jié)Sirt1的表達發(fā)揮生物學作用〔7，8〕，目前關于miR-9-3p對于HepG2細胞中Sirt1表達水平的研究未見報道。本研究通過檢測T2DM患者血漿中miR-9-3p的表達水平，檢測miR-9-3p對HepG2細胞Sirt1表達的影響，探討血漿miR-9-3p在T2DM診療中的價值及miR-9-3p在T2DM發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年6月唐山市工人醫(yī)院內分泌科收治住院的T2DM患者47例為T2DM組；T2DM患者納入標準：①符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標準的T2DM患者；②BMI 18.5～30.0 kg/m2；③無影響糖代謝的內分泌疾病或其他疾病。T2DM診斷標準：依據1999年WHO標準即葡萄糖耐量試驗：口服溶于300 ml水內的無水葡萄糖粉75 g，空腹靜脈血糖 ≥7.0 mmol/L，負荷后2 h靜脈血糖 ≥11.1 mmol/L。排除標準：①1型糖尿病患者；②C肽缺乏的患者；③血壓≥180/110 mmHg；④肝功能異常：谷丙轉氨酶(ALT)≥實驗室正常值范圍上限的2.5倍；⑤腎功能不全：血清肌酐≥1.5 mg/dl；⑥T2DM大血管、微血管并發(fā)癥患者及近期出現(xiàn)糖尿病急性并發(fā)癥患者；⑦近期有手術、外傷、感染及其他應激狀態(tài)的患者；⑧有嚴重的系統(tǒng)性疾病，如心血管、消化、呼吸、神經、免疫、其他內分泌系統(tǒng)疾病等及惡性腫瘤病史；⑨目前妊娠、哺乳期的患者。另選同期年齡性別與之相匹配的醫(yī)院體檢中心體檢健康人員28例為對照組。T2DM組男27例，女20例，平均年齡(54±10)歲，對照組男14例，女14例，平均年齡(55±7)歲，兩組性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇比較無顯著差異(P>0.05)；兩組空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平存在差異顯著(P<0.001)，見表1。本研究由唐山工人醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本的采集 所有研究對象禁食8 h，清晨空腹肘靜脈采血。

1.2.2血漿總RNA的提取 使用mirVana Paris試劑盒提取血漿總RNA，按照說明書操作，置于-80℃冰箱凍存。

1.2.3cDNA的合成 應用qRT-PCR(Taqman探針法)配制RT-PCR體系，反應體系為8 μl，10×緩沖液0.8 μl、dNTP 0.2 μl、inhibition 0.1 μl、RNA 4.5 μl、RNase-free H2O 0.4 μl、RNA Primer 1.5 μl、RTase 0.5 μl，全過程均于冰浴完成。設定反應條件：16℃孵育60 min、42℃孵育60 min、85℃孵育5 min、4℃Forever。

1.2.4qRT-PCR配制 2× TaqMAN universal PCR Master Mix 10 μl、cDNA 4 μl、無核糖核酸酶(RNase-free)H2O 5 μl、TaqMAN probe 1 μl，總反應體系為20 μl；反應條件為：95℃ 10 min起始模板預變性，95℃ 15 s中模板變性、60℃ 60 s退火循環(huán)40次；每個樣本均做副管，重復3次，記錄實驗CT值，取平均值，后經2-ΔΔCt轉換后進行統(tǒng)計學分析。

1.3細胞實驗分組及方法

1.3.1實驗分組 HepG2細胞系由中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎研究所細胞中心提供。實驗分為兩組，miR-9-3p轉染組：HepG2細胞系體外轉染miR-9-3p mimics，陰性對照組：HepG2細胞系體外培養(yǎng)不轉染miR-9-3p mimics培養(yǎng)條件與轉染組相同。

1.3.2細胞培養(yǎng) 將復蘇后的HepG2細胞的試管加入適量含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成105/ml濃度移至培養(yǎng)瓶中，置于37%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待細胞生長鋪滿瓶壁即可傳代。

1.3.3細胞轉染 將配制好的miR-9-3pmimic轉染復合物250 μl，加入到培養(yǎng)好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培養(yǎng)基750 μl/孔，加入到各孔中，前后輕柔搖動細胞板至混合均勻。將細胞培養(yǎng)板置于 37℃ 5.0%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉染6 h后吸取1 ml普通DMEM培養(yǎng)基(含有20%胎牛血清、無抗生素)，加入各孔。

1.3.4細胞qRT-PCR ①提取細胞總RNA：使用mirVana Paris Kit試劑盒提取細胞總RNA，按照說明書操作，將離心管置于-80℃冰箱保存。②mRNA qRT-PCR(SYBR Green法)操作全過程需在冰浴上進行，Sirt1引物序列：上游5′ CTACTGGTCTTACTT-TGAGGG3′、下游5′CAAGGGATGGTATTTATGCT3′；β-actin引物序列：上游5′ACAGAGCCTCGCCTTTG-C3′、下游5′CCACCATCACGCCCTGG3′，反應體系如下：2×One Step SYBR?RT-PCR緩沖液410 μl、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2、1.0 μl、PCR Forward Primer(10 μmol/L)1.0 μl、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1.0 μl、Total RNA 4.0 μl(400 ng)、RNase Free H2O 3 μl，總反應體系為20 μl，反應條件：反轉錄反應42℃ 30 min、95℃ 10 min，PCR 95℃ 10 s、60℃ 60 s循環(huán)40次。

1.3.5Western印跡細胞總蛋白的提取 細胞轉染完成后應用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后應用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解獲得細胞總蛋白，應用考馬斯亮藍法測蛋白濃度，之后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳過后取目的蛋白條帶恒流200 mA，轉膜1 h。轉膜完成后，將膜用TBST水洗完后，放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗體與一抗稀釋液，將封閉好的膜放入配好的一抗稀釋液，4℃搖床過夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗與二抗稀釋液，將膜放入配好的二抗稀釋液，常溫搖床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實驗結果。

1.3.6考馬斯亮藍法測蛋白濃度 應用分光光度計測定并計算每管蛋白的吸光度值，制作出標準曲線。吸取3 μl待測蛋白液，加入到100 μl考馬斯亮藍顯色液，用分光光度計測定并計算出吸光度值，計算出待測蛋白的濃度。

1.3.7轉膜及顯色 電泳分離蛋白分子，轉膜，將膜放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。加一抗，4℃搖床過夜。加二抗，常溫搖床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實驗結果。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0及GraphPAD Prism5.0軟件進行χ2檢驗，t檢驗，非參數(shù)檢驗；應用受試者工作特征(ROC)曲線分析計算出ROC曲線下面積(AUC)和95%CI。

2 結 果

2.1兩組血漿中miR-9-3p表達水平 T2DM組血漿miR-9-3p的表達水平〔0.033(0.004，0.209)〕明顯高于對照組〔0.004(0.002，0.006),P=0.000 5〕。

2.2ROC曲線分析血漿miR-9-3p對于T2DM的診斷價值 以健康人群為對照組評價miR-9-3p對于T2DM的診斷價值，AUC=0.742，介于0.7～0.9之間，說明miR-9-3p對于T2DM診斷有一定準確性(95%CI0.628～0.857，P=0.000 5)。見圖1。

2.3miR-9-3p對HepG2細胞 Sirt1轉錄水平的影響 HepG2細胞miR-9-3p轉染組Sirt1 mRNA水平(0.877±0.255)與陰性對照組(1.003±0.429)相比，無顯著差異(P=0.30)。

2.4miR-9-3p對HepG2 細胞Sirt1蛋白水平的影響 miR-9-3p轉染組Sirt1蛋白水平(0.174±0.013)顯著低于陰性對照組(0.623±0.044，P=0.017)。

3 討 論

miR-9-3p在調節(jié)胰島β細胞分泌胰島素過程中起重要作用。Plaisance等〔9〕的研究最早證實：當胰島β細胞內miR-9-3p表達水平升高時，miR-9-3p通過作用于轉錄調節(jié)因子來抑制胰島β細胞的分泌功能。之后Ramachandran等〔10〕通過模擬糖尿病發(fā)病時體內的高糖環(huán)境再一次證實，在高糖刺激胰島素分泌的過程中，胰島β細胞中miR-9-3p表達水平呈顯著性升高，并通過體內實驗進一步證實Sirt1具有促進胰島素分泌的作用，最后在胰島β細胞中證實miR-9-3p的升高能夠使Sirt1蛋白表達水平顯著降低。郭東更等〔11〕以新發(fā)的T2DM患者和正常糖耐量人員外周血單個核細胞為研究對象，研究結果表明初發(fā)T2DM患者外周血單個核細胞中miR-9-3p水平顯著上調，并且其三酰甘油水平也是上調的。

Sirt1對于提高組織胰島素敏感性、促進胰島素分泌和調節(jié)脂類代謝的平衡發(fā)揮重要作用，目前研究證實，若降低Sirt1蛋白表達水平或降低其蛋白活性均能夠導致胰島素抵抗的發(fā)生，科學家檢測出高脂飲食飼養(yǎng)的小鼠體內Sirt1蛋白質水平顯著降低并且小鼠表現(xiàn)為過早衰老〔12，13〕，除此之外，人工培養(yǎng)的胰島素敏感細胞如HepG2細胞及平滑肌細胞中，如抑制Sirt1蛋白的表達水平會促進胰島素抵抗的發(fā)生〔14〕。Adlakha等〔15〕運用免疫印跡法證實，在HepG2細胞中miR-128通過介導Sirt1表達水平進一步調節(jié)ATP結合盒轉運蛋白G1的表達水平，參與體內脂質代謝。Nakae等〔16〕研究顯示，肥胖小鼠肝臟特異性敲除Sirt1基因的表達，不僅升高小鼠血糖水平，增加胰島素抵抗的產生，同時檢測到游離脂肪酸和膽固醇水平顯著提高，證明Sirt1在提高胰島素敏感性及調節(jié)血脂方面具有重要作用。也有研究證實，在HepG2細胞和小鼠肝臟中增加Sirt1蛋白表示水平，能夠激活基底腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)-激活蛋白激酶，能夠防止脂肪酸合酶誘導的脂質聚積及其所引起的血糖水平升高及胰島素抵抗〔17〕。本研究證實miR-9-3p調節(jié)Sirt1蛋白水平的表達。證實miR-9-3p通過轉錄后水平調節(jié)HepG2細胞 Sirt1表達。本研究通過細胞試驗進一步證實miR-9-3p能夠靶向抑制Sirt1蛋白的表達，參與調控胰島素抵抗和脂質代謝途徑，對T2DM胰島素抵抗及血脂異常的發(fā)生可能起到促進作用。