肉桂提取物對阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶和氧化應(yīng)激水平的影響及機(jī)制

李冉 田子明

(焦作職工醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)教研室，河南 焦作 454000；2臨床部)

阿爾茨海默病(AD)又稱原發(fā)性老年癡呆，是一種在老年人中最常見的不可逆的神經(jīng)退行性疾病，會(huì)損傷患者認(rèn)知、行為和學(xué)習(xí)能力。該神經(jīng)退行性疾病的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Aβ)和過度磷酸化的tau聚集體，分別形成淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié),從而引起神經(jīng)元功能障礙和突觸可塑性受損。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與Aβ有關(guān)〔1〕。肉桂為我國藥食同源的傳統(tǒng)藥物及香料，具有補(bǔ)火助陽、溫煦氣血、散寒止痛、溫通經(jīng)脈等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，肉桂含有揮發(fā)油、黃酮類、萜類等多種化學(xué)成分，具有擴(kuò)張血管、抗胃潰瘍、抑菌、抗氧化等作用〔2〕。本文擬分析不同劑量肉桂提取物對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和氧化應(yīng)激水平的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 SPF級(jí)SD雄性大鼠，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001。隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組，模型組，低、中、高劑量組和陽性藥物對照組，每組9只。

1.2主要藥品和試劑 肉桂購于亳州中藥材市場；吡拉西坦購于東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H21021775，規(guī)格：0.4 g×100片×1瓶/盒；Hoechst 33342溶液購于上海信裕生物科技有限公司；大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs )酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、大鼠丙二醛(MDA) ELISA試劑盒均購于上海瓦蘭生物科技有限公司；大鼠過氧化氫酶(CAT)ELISA試劑盒購于武漢菲恩生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒購于武漢益普生物科技有限公司；SOD1、SOD2、絡(luò)氨酸激酶受體(Trk)B、β-actin抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、p-TrkB、NeuN、山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP) 購于英國Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購于愛必信(上海)生物科技有限公司。

1.3主要儀器 Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司〕；DMI6000B熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；Gel Doc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；XR-XM101大小鼠Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.4模型構(gòu)建和分組 參照參考文獻(xiàn)〔3〕的方法構(gòu)建AD大鼠模型。使用二甲基亞砜(DMSO)溶解Aβ25～35，置于37℃培養(yǎng)箱中老化處理7 d。使用10%水合氯醛麻醉大鼠，切開頭部皮膚，在海馬區(qū)位置緩慢注射Aβ25～35，術(shù)后縫合，在傷口處滴加青霉素防止傷口感染。對照組注射等量生理鹽水。

造模成功次日，低、中、高劑量組每日灌胃給藥終濃度分別為200、400和600 mg/kg肉桂提取物〔4〕。陽性藥物對照組采用0.5 g/kg吡拉西坦灌胃。對照組和模型組每日灌胃等量生理鹽水，連續(xù)灌胃60 d。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組學(xué)習(xí)記憶能力〔5,6〕在所有象限內(nèi)提供均勻照明，并為大鼠提供固定的視覺線索。在水迷宮中注入清水，沒過平臺(tái)1 cm，加入適量二氧化鈦粉使水不透明。保持水池溫度在(22±2)℃。每只大鼠訓(xùn)練2次/d，在連續(xù)訓(xùn)練4 d后開始隱匿平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)，即將大鼠面向池壁從東、南、西、北4個(gè)象限中的任一方位入水點(diǎn)放入水池，記錄大鼠從入水至找到平臺(tái)的時(shí)間即為逃避潛伏期。未能在60 s內(nèi)找到平臺(tái)的大鼠，將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留15 s，將其逃避潛伏時(shí)間記為60 s。每次更換入水象限進(jìn)行測試，共測試4 d。在隱匿平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將平臺(tái)撤出，將大鼠放入水中90 s，測定大鼠游泳距離和進(jìn)入平臺(tái)次數(shù)，確定到達(dá)準(zhǔn)確平臺(tái)位置的延遲時(shí)間。每次訓(xùn)練完成后將小鼠立即取出并擦干保溫以避免應(yīng)激反應(yīng)。

1.6ELISA試劑盒檢測AD大鼠氧化應(yīng)激的影響 在行為學(xué)檢測后，處死大鼠，收集各組海馬組織，將海馬組織充分研磨勻漿，離心取上清，分別按照AGEs、MDA、CAT和SOD ELISA試劑盒說明書操作，檢測海馬組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。

1.7Western印跡檢測各組海馬組織中SOD1和SOD2表達(dá)情況〔7〕取大鼠海馬組織，液氮研磨，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，每孔蛋白質(zhì)上樣量固定為30 μg。將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉。TBST洗膜后，將PVDF膜放入一抗稀釋液〔SOD1(1∶1 000)、SOD2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)〕中，4℃孵育過夜。棄去一抗稀釋液，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。使用ECL試劑盒顯影，全自動(dòng)凝膠成像儀拍照，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算SOD1蛋白和SOD2蛋白的相對表達(dá)量。

1.8免疫熒光檢測海馬組織中NeuN表達(dá)情況〔8〕將各組海馬組織使用4%多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)操作，石蠟包埋切片，將切片貼在載玻片上，加入封閉溶液室溫封閉1 h。然后，將切片放置在一抗溶液(NeuN 1∶500)中，4℃孵育過夜，沖洗切片，加入二抗溶液室溫浸泡2 h。然后用Hoechst 33342溶液染色切片。沖洗蓋玻片3次，用甘油膠覆蓋，并在熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.9Western印跡檢測各組BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況〔9〕取各組海馬組織進(jìn)行Western印跡分析。使用SDS-PAGE分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗溶液(稀釋比例均為1∶1 000)，在4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗溶液室溫下孵育2 h。顯影，拍照，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肉桂提取物對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 模型組與對照組相比，游泳距離明顯增加，進(jìn)入平臺(tái)次數(shù)明顯減少，延遲到平臺(tái)時(shí)間明顯增長，逃避潛伏期時(shí)間明顯增長(P<0.05)。與模型組比較，不同劑量組和陽性藥物對照組逃避潛伏期、游泳距離及延遲到平臺(tái)時(shí)間明顯縮短，進(jìn)入平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2肉桂提取物對AD大鼠氧化應(yīng)激的影響 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中AGEs和MDA水平明顯升高，CAT和SOD水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量組及陽性藥物對照組AGEs和MDA水平明顯降低，CAT和SOD水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.3肉桂提取物對AD大鼠海馬組織SOD表達(dá)的影響 模型組海馬組織中SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平較對照組明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量組及陽性藥物對照組明顯升高(P<0.05)。見圖1，表3。

表3 各組海馬組織中SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平比較

2.4肉桂提取物對AD大鼠海馬組織NeuN表達(dá)的影響 模型組NeuN表達(dá)水平〔(21.58±2.31)%〕較對照組〔(64.71±4.76)%〕明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，肉桂提取物不同劑量組〔低、中、高劑量組(34.78±1.66)%、(38.82±2.19)%、(44.88±1.93)%〕和陽性藥物對照組〔(37.27±2.81)%〕均可明顯增加海馬組織中NeuN的表達(dá)。見圖2。

圖2 各組海馬組織中NeuN表達(dá)(免疫熒光，×100)

2.5肉桂提取物對AD大鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路的影響 各組海馬組織中TrkB蛋白水平無明顯差異(P>0.05)。模型組海馬組織中BDNF和p-TrkB蛋白水平較對照組明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量組和陽性藥物對照組BDNF和p-TrkB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 各組海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

表4 各組海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

AD是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，影響著全球大多數(shù)老年人。血腦屏障(BBB)是維持大腦結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)微環(huán)境的必要條件〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，在AD病理過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞活化是活性氧簇(ROS)的主要慢性來源之一，從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性和BBB功能損害。Burak等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，肉桂可能是一種有前途的以炎癥和氧化應(yīng)激增加為特征的治療神經(jīng)退行性疾病的藥物，能夠在AD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜憩F(xiàn)出顯著的促認(rèn)知作用，包括氧化應(yīng)激減少和顯著抑制β-分泌酶活性〔11〕。NeuN是一種位于神經(jīng)元核內(nèi)的特異性核蛋白，是在神經(jīng)退行性疾病的研究中常用的量化正常神經(jīng)元和識(shí)別神經(jīng)元缺失的標(biāo)志物，退化的神經(jīng)元往往會(huì)失去這一標(biāo)志物〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)ROS等自由基顯著增加，超過機(jī)體本身的清除能力，造成氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，最終造成細(xì)胞損傷或凋亡〔13〕。SOD1 是一種主要的抗氧化劑酶。SOD2是一種線粒體解毒酶，能催化超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫，可以保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損害。SOD和CAT可以消除超氧化物和過氧化氫，MDA 可以反映氧化應(yīng)激損傷的程度，其水平升高可以直接反映其遭受了過度的氧化應(yīng)激損傷〔14〕。肉桂提取物可以明顯降低AD大鼠海馬組織中AGEs和MDA的產(chǎn)生和積累，增加CAT和SOD的活性；且隨著肉桂提取物所用劑量的提高，海馬組織中SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平也逐漸升高。王燕軍〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與 BDNF 信號(hào)通路相互影響在糖尿病認(rèn)知功能的病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，BDNF/TrkB通路的激活，有助于改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔16〕。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，在成熟后與激活TrkB結(jié)合并激活TrkB，參與神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)控，在AD的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔17〕。本實(shí)驗(yàn)中，肉桂提取物可以明顯升高BDNF和p-TrkB的表達(dá)水平，激活BDNF/TrkB通路，從而對AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力起到改善作用。

綜上，肉桂提取物對AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有一定改善作用，增強(qiáng)氧化應(yīng)激能力，其作用機(jī)制主要與BDNF/TrkB通路的激活有關(guān)。