基于PINK1/Parkin通路探討靈芝孢子對糖尿病腎病模型大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響

周廣旭 齊亞靈 周少波 吳可佳 張瑩 石瑞平 秦麗微 王淑湘 付宏揚 張欣 王淑秋

(1佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2海南醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；3貝德福德大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物與環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所；4佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)是1型和2型糖尿病的一種由不受控制的高血糖長期累積腎單位進(jìn)而損傷微血管的并發(fā)癥〔1〕，嚴(yán)重者可造成終末期腎衰竭，在DN發(fā)生發(fā)展過程中會出現(xiàn)腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生、擴張、腎小管萎縮等病理改變〔1,2〕。自噬是細(xì)胞識別并分解自身異常成分、自我保護(hù)的過程。在自噬過程中，雙膜小泡會吞噬錯誤折疊、聚集的蛋白質(zhì)和功能失調(diào)的細(xì)胞器，最終被溶酶體降解〔3〕。線粒體自噬可以抑制炎癥〔4〕，減少細(xì)胞死亡信號，防止細(xì)胞在遇到各種刺激后發(fā)生損害〔5〕。PTEN誘導(dǎo)假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)途徑通過調(diào)控自噬可及時識別并有效地清除異常線粒體，抑制氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)〔6〕。實驗證實，在高糖狀態(tài)下培養(yǎng)的足細(xì)胞，上調(diào)PINK1蛋白表達(dá)，可減少活性氧的生成，減輕足細(xì)胞損傷，使其功能蛋白正常表達(dá)〔7〕。

血糖的累積可損害腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，過度產(chǎn)生的活性氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強，進(jìn)一步激活凋亡途徑〔8〕，導(dǎo)致廣泛功能障礙。靈芝在中國有千年藥用史，對機體健康具有有益功效,是一種藥食兩用的真菌〔9〕。靈芝孢子用途廣泛，目前已有研究表明，靈芝孢子通過改變巨噬細(xì)胞極性抑制肝癌細(xì)胞生長〔10〕。靈芝孢子具有明顯降血脂、降血糖、抗氧化等作用，研究表明，通過靈芝進(jìn)行干預(yù)的糖尿病實驗，干預(yù)組大鼠血脂降低，高血糖癥改善，胰島素敏感增強性，糖耐量明顯改善〔11〕。目前尚無關(guān)于靈芝孢子對DN模型大鼠中PINK1/Parkin信號通路潛在的自噬和凋亡的影響的研究。本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DN模型大鼠為研究對象并給予靈芝孢子灌胃治療，通過生化指標(biāo)試劑盒檢測大鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo)水平、腎臟病理及自噬與凋亡的相關(guān)指標(biāo)，探討基于PINK1/Parkin通路靈芝多糖對DN模型大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的主要影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 從哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心購進(jìn)32只雄性SD大鼠〔實驗動物許可證號：SYXK(黑)2016-014〕，體重180～200 g。

1.2實驗試劑 STZ(Sigma公司)，PINK1、Parkin、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2均購自博士德生物工程有限公司，P62購自碧云天生物公司，微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3購自美國Abcam公司，激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-Caspase)3購自CST公司。尿蛋白定量測定法(CCB)尿蛋白試劑盒、血清肌酐檢測試劑盒及脲酶法尿素氮測試盒(批號均為：20201213，南京建成)、Masson染色試劑盒(貨號：20210320)、過碘酸希夫反應(yīng)(PAS)染色液試劑盒(貨號：20210320)均購自北京索萊寶公司，靈芝孢子購自黑龍江省佳木斯市靈芝養(yǎng)殖場。

1.3DN模型制備和分組 32只SPF級雄性SD大鼠以躲避強光和噪聲，自由飲食和水喂養(yǎng)1 w。應(yīng)用隨機數(shù)字表法分為正常對照(NC)組、高脂高糖(HF)組、DN模型(DN)組、靈芝孢子(GLSP)組各8只。HF組、DN組、GLSP組飼喂高脂高糖飼料(基礎(chǔ)飼料59%，白糖20%，豬油18%，蛋黃3%)28 d。禁食不禁水12 h后，DN組和GLSP組采用腹腔注射STZ(50 mg/kg)，NC組和HF組按相同環(huán)境、相同方法注射枸櫞酸-枸櫞酸鹽緩沖液(根據(jù)體重計算相應(yīng)大鼠的注射量)。注射完畢后不立刻給予食物，2 h后直接飲用葡萄糖。3 d后，用眼科剪刀剪斷尾部末端取血檢測選擇血漿葡萄糖≥16.7 mol/L的大鼠。模型制備成功后，GLSP組每日灌胃給予靈芝孢子〔300 mg/(kg·d)〕，其余3組灌胃給予等量生理鹽水。每周固定時間測定空腹血糖。12 w后麻醉處死。

1.4取材與處理 待大鼠狀態(tài)穩(wěn)定后，用無菌生理鹽水配制0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)溶液腹腔注射麻醉大鼠，分離出腎臟血管將其夾閉，從腹主動脈處進(jìn)針采血 1 ml。取出腎臟組織并剝離腎臟被膜，一部分置于10%甲醛溶液固定24 h并標(biāo)注分組，以用于蠟塊包埋進(jìn)行病理學(xué)檢查及免疫組化分析。其余腎組織分成小塊分組分裝在EP管內(nèi)并放在-80℃冰箱中保存，用于進(jìn)一步Western印跡檢測相關(guān)蛋白。

1.5腎臟組織病理學(xué)檢測 將腎臟用10%甲醛溶液固定并包埋，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、PAS染色和Masson染色，用光學(xué)顯微鏡分別進(jìn)行組織形態(tài)病理學(xué)觀察、系膜細(xì)胞及基底膜觀察、腎臟纖維化程度。

1.624 h尿蛋白、血清肌酐及尿素氮檢測 24 h尿蛋白檢測：將大鼠分批次置于金屬代謝籠中正常飲水并禁食1 d(注意大鼠糞便)，收集尿液并按照編號標(biāo)識保存。充分混勻，靜置5 min，波長595 nm，雙蒸水調(diào)零，利用全自動酶標(biāo)儀Synergy HT測定各管吸光度值。血清肌酐及尿素氮檢測：將裝有全血的分離膠試管在3 500 r/min條件，離心30 min后，EP管分裝血清，-80℃條件保存。分別用尿素氮試劑盒和肌酐測定試劑盒進(jìn)行檢測。

1.7腎臟組織病理學(xué)檢測 將充分固定完成的腎臟進(jìn)行石蠟包埋并切片，分別進(jìn)行HE染色、PAS染色和Masson染色，用光學(xué)顯微鏡分別進(jìn)行組織形態(tài)病理學(xué)觀察、系膜細(xì)胞及基底膜觀察、腎臟纖維化程度。

1.8免疫組化檢測 60℃恒溫箱烤片15 min，新鮮二甲苯2次脫蠟，放置100%、95%、90%、85%、80%、75%乙醇脫水，枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.2)熱修復(fù)抗原，磷酸鹽緩沖液(PBS)振蕩沖洗，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液37℃水浴箱孵育，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗4℃冰箱過夜，PBS洗滌，滴加生物素化的抗兔或抗鼠二抗放置濕盒37℃孵育，滴加鏈霉親和素生物復(fù)合物(SABC)放置濕盒37℃孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1～5 min，蘇木素輕度復(fù)染并藍(lán)化1～2 h，脫水至透明，中性樹膠封片烘干，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像采集，并對陽性面積進(jìn)行分析。

1.9TUNEL檢測法觀察腎臟組織凋亡細(xì)胞分布及凋亡率情況 60℃恒溫箱烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.2)熱修復(fù)，50 μl 3%H2O2室溫避光靜置，50 μl TUNEL反應(yīng)緩沖液(此步驟之后直至熒光觀察前的所有實驗步驟需避光進(jìn)行)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光淬滅劑封片。制成的片子應(yīng)立即觀察，或避光保存于-20℃，1 w之內(nèi)進(jìn)行觀察。陽性細(xì)胞核呈綠色熒光。

1.10Western印跡檢測 RIPA裂解液研磨腎臟組織，離心取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測蛋白濃度，置膠，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，電泳：恒壓80 V，marker跑出紅線轉(zhuǎn)恒壓120 V，溴酚藍(lán)即將跑出膠板，轉(zhuǎn)膜：恒電流260 mA，30 min，封閉：5 % 脫脂奶粉37℃孵育，一抗4℃過夜，洗膜孵育TBST稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，用BeyoECL Plus發(fā)光液在DM4000B圖像信號采集分析系統(tǒng)中檢測信號強度大小，再用Image J1.8軟件分析條帶光密度值，并與GAPDH內(nèi)參吸光度的比值進(jìn)行相對表達(dá)量的計算。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)比較 與造模前比較，DN組大鼠體重減輕，嗜睡而且反應(yīng)遲緩，飲食增加，毛發(fā)雜亂不柔順，小便異常頻繁，墊料的濕度在同一時間內(nèi)相比其他組要更嚴(yán)重。而GLSP組大鼠，精神比較活躍，對外界刺激有明顯的躲避行為，但毛發(fā)無明顯變化。

2.2各組空腹血糖、血清尿素氮、血肌酐及24 h尿蛋白水平比較 與NC組相比，DN組空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐及尿素氮水平明顯增多(P<0.01)，而HF組空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐及尿素氮水平無明顯變化(P>0.05)；與DN組與HF組相比，GLSP組空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐及尿素氮水平明顯降低(均P<0.01)，見表1。

2.3各組腎臟組織病理學(xué)觀察 HE染色觀察大鼠腎臟形態(tài)病理學(xué)改變：NC組與HF組腎單位輪廓清晰，形態(tài)正常。在DN組中，腎小體直徑增大，且部分腎小球內(nèi)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞，部分腎小囊消失，腎小管內(nèi)出現(xiàn)蛋白管型，管壁變厚并伴水腫。經(jīng)靈芝孢子干預(yù)，GLSP組腎小球內(nèi)炎性細(xì)胞減少，腎小球直徑減小，腎小管管壁均有改善。PAS染色觀察大鼠腎臟形態(tài)病理學(xué)改變：DN組病理改變主要表現(xiàn)為腎小球體積增大，腎小球內(nèi)有深淺不一紅色淡染的陽性物質(zhì)沉積，腎小球基底膜均質(zhì)性增厚，系膜細(xì)胞增生，腎小囊基底膜明顯增厚。與DN組相比，GLSP組腎小球中見少許紅色淡染的陽性物質(zhì)沉積，病變程度均減輕。NC組及HF組腎單位基本正常，未見明顯的紅色淡染的糖原沉積。Masson染色觀察腎臟纖維化改變：DN組的腎小球內(nèi)膠原纖維明顯增加(膠原纖維呈藍(lán)色)，GLSP組腎臟組織呈部分藍(lán)染膠原纖維沉積，NC組呈紅染狀態(tài)，HF組呈部分藍(lán)染膠原纖維沉積。見圖1。

圖1 靈芝孢子對腎臟組織病理變化及形態(tài)學(xué)的影響(×400)

2.4各組免疫組化檢測結(jié)果 DN組相比NC組腎臟P62、Bax蛋白陽性著色覆蓋面積增多，蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白陽性著色覆蓋面積減少，蛋白表達(dá)降低，HF組腎臟P62、Bax蛋白陽性著色覆蓋面積增多，蛋白表達(dá)模式表現(xiàn)出較強的反應(yīng)性，Bcl-2蛋白陽性著色覆蓋面積減少，這種反應(yīng)性明顯降低；與DN組相比，GLSP組腎臟P62蛋白陽性著色覆蓋面積減少，表達(dá)降低、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，陽性著色覆蓋面積減少，Bcl-2蛋白陽性著色覆蓋面積增多，表達(dá)模式表現(xiàn)出較強的反應(yīng)性。見圖2。

圖2 各組腎臟中P62、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

2.5各組腎臟細(xì)胞凋亡水平 NC組、HF組、DN組及GLSP組細(xì)胞凋亡率依次為(1.88±0.18)%、(6.77±0.45)%、(7.52±0.24)%、(4.06±0.31)%。NC組熒光強度較弱，腎臟細(xì)胞多數(shù)保持正常，有極少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡；與NC組相比，DN組中熒光強度增強，HF組中凋亡細(xì)胞明顯增加(P<0.01)；與DN組相比，GLSP組中細(xì)胞熒光強度明顯下降(P<0.01)。見圖3。

圖3 TUNEL檢查法觀察各組腎臟細(xì)胞凋亡情況(×400)

2.6Western印跡法檢測各組自噬蛋白表達(dá) 與NC組相比，DN組腎臟PINK1、Parkin蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低，而P62蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.01)；與DN組相比，GLSP組腎臟PINK1、Parkin蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，而P62蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.01)。見表2、圖4。

圖4 各組腎臟中PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達(dá)

2.7靈芝孢子預(yù)防DN大鼠的腎臟細(xì)胞凋亡 與NC組相比，DN組腎臟Bcl-2/Bax比值顯著下調(diào)，Caspase3、Cleaved-Caspase3表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與DN組相比，GLSP組腎臟Bcl-2/Bax比值明顯升高，Caspase3、Cleaved-Caspase3表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見表2、圖5。

圖5 各組腎臟Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)

3 討 論

本研究使用高脂高糖飲食聯(lián)合腹腔注射STZ誘導(dǎo)大鼠制備T2DM模型〔12～15〕，發(fā)現(xiàn)單純給予高脂高糖飼養(yǎng)的大鼠與正常飼料飼養(yǎng)的大鼠相比，血糖無明顯變化，體重有略微增加，但相關(guān)蛋白有所改變，說明高脂高糖的不良飲食習(xí)慣會造成相關(guān)組織的損傷。通過分析大鼠腎臟細(xì)胞的損傷過程發(fā)現(xiàn)，受損的足細(xì)胞引起腎臟濾過大量的蛋白進(jìn)而引發(fā)相關(guān)疾病〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)DN組大鼠尿液中出現(xiàn)大量的尿蛋白。

正常情況下，正常細(xì)胞受到任何刺激都可影響自噬的發(fā)生。當(dāng)沒有刺激時，機體由于衰老、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的丟棄、能量的回收等原因，自噬水平會有輕微的波動。正常細(xì)胞可通過線粒體自噬調(diào)節(jié)自身穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到各種因素刺激時，通過PINK1/Parkin通路識別異常的線粒體并與溶酶體結(jié)合最終被水解酶降解。實驗證實，高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞活性氧顯著增加造成線粒體損傷，上調(diào)PINK1后活性氧顯著下降，通過調(diào)控自噬進(jìn)一步清除受損的線粒體〔7〕。

PINK1是清除受損線粒體過程中所必需的蛋白，并進(jìn)一步激活Parkin蛋白。本研究結(jié)果表明給予靈芝孢子治療可激活DN模型大鼠腎臟細(xì)胞中保護(hù)性自噬。

線粒體損傷是引起細(xì)胞功能異常進(jìn)而造成細(xì)胞死亡的主要原因〔16〕，過度產(chǎn)生的活性氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激，三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生受到阻礙，細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的損傷〔17,18〕。凋亡是細(xì)胞自發(fā)的、有規(guī)律的,是為了清除功能異常的細(xì)胞而維持穩(wěn)態(tài)。當(dāng)抑制正常細(xì)胞凋亡時，會引起癌癥或相關(guān)疾病的產(chǎn)生，而激活細(xì)胞凋亡則會導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變及加重腎缺血再灌注損傷〔19,20〕。細(xì)胞凋亡時會伴隨Bax結(jié)合線粒體復(fù)合物，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和其他抗凋亡蛋白能夠有效抑制線粒體上的促凋亡蛋白(tBid)/Bax或Bax/Bax復(fù)合體形成〔21〕。

本研究結(jié)果表明，隨著給予靈芝孢子治療，不僅可以改善大鼠腎功相關(guān)生化水平，而且血糖水平也得到了改善，靈芝孢子可能通過PINK1/Parkin通路，調(diào)節(jié)線粒體自噬，抑制重要的促凋亡蛋白表達(dá)，改善高血糖癥，腎臟功能得以保障。但其具體的調(diào)節(jié)機制尚未明確，可進(jìn)一步研究靈芝孢子對于氧化應(yīng)激、線粒體動力相關(guān)蛋白及炎癥等方向的關(guān)注。

綜上，靈芝孢子可能基于PINK1/Parkin通路，改善高血糖癥，減輕腎臟纖維化，通過激活腎臟細(xì)胞的保護(hù)性自噬，進(jìn)而抑制腎臟細(xì)胞凋亡，提高腎臟濾過能力，改善腎臟細(xì)胞損害從而保護(hù)腎臟。