氟比洛芬酯預(yù)處理對(duì)大鼠窒息性心搏驟停后腦損傷和生存率的影響

董天鑫 張?jiān)迄i 曹雪峰 劉秀蘭 郭淑娟 李艷

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河北 承德 067000；2承德市雙灤區(qū)婦幼保健院麻醉科)

心搏驟停過了黃金5 min后，大腦就會(huì)因?yàn)樵俟嘧?dǎo)致的繼發(fā)性多器官紊亂而出現(xiàn)不可逆損傷〔1,2〕，這是因?yàn)槟X神經(jīng)元在缺氧后喪失了恢復(fù)正常功能的能力。神經(jīng)元的信號(hào)傳導(dǎo)建立在腦神經(jīng)元胞外和胞內(nèi)間隙之間的Ca2+、Na+和K+交換的基礎(chǔ)上，因此消耗大量以三磷酸腺苷(ATP)為形式的能量。在心搏驟停后無氧代謝為主要形式，ATP產(chǎn)量非常低，乳酸和H+水平升高，細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Na+過度累積。長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載導(dǎo)致線粒體通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放，進(jìn)而激活caspase-3，參與細(xì)胞凋亡，最終細(xì)胞出現(xiàn)不可逆死亡〔3,4〕。以上就是心搏驟停之后的腦細(xì)胞死亡過程。

目前對(duì)于心搏驟停之后腦細(xì)胞的保護(hù)，有一定的研究進(jìn)展。其中比較成熟的是低溫保存，其原理在于保護(hù)離子泵的功能，降低神經(jīng)毒性〔5,6〕。此外，阿片肽類藥物也是常用的缺氧性腦損傷的保護(hù)藥物，其原理在于阿片類藥物可降低環(huán)磷酸腺苷(CAMP)水平，從而阻斷Na+通道能力〔7,8〕。臨床研究也證實(shí)，阿片類藥物預(yù)處理在急性缺氧后可以保護(hù)許多器官和組織的細(xì)胞完整性，包括：腸〔9〕、心肌〔10〕和腦〔11〕等，因此用于器官移植前的預(yù)處理。此外，心搏驟停誘導(dǎo)的腦缺血會(huì)造成腦組織的炎癥反應(yīng)，而腦缺血再灌注后白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附，造成腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損〔12〕。既往研究表明，氟比洛芬酯的使用可減輕大鼠短暫性腦缺血再灌注導(dǎo)致的損傷，其原理可能與氟比洛芬酯對(duì)于環(huán)氧化酶(COX)-2通路的抗感染作用影響及對(duì)于線粒體相關(guān)蛋白合成增加有關(guān)〔13〕。本研究通過窒息性心搏驟停大鼠模型觀察嗎啡或氟比洛芬酯預(yù)處理對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)、酸堿狀態(tài)、腦損傷和早期存活的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究共使用成年雄性SD大鼠45只，體重350～400 g，由承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)均在該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。大鼠飼養(yǎng)在常規(guī)條件下〔溫度(25±2)℃；相對(duì)濕度(50±10)%；12 h明暗周期〕，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1 w，并在手術(shù)前禁食過夜。本研究得到承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作方法 在硫噴妥鈉60 mg/kg腹腔麻醉下，切開大鼠氣管并連接小動(dòng)物TOPO雙模式呼吸機(jī)(Kent，美國)，室內(nèi)空氣條件下進(jìn)行潮氣量為8 ml/kg的機(jī)械通氣。從右股靜脈置入24 G中心靜脈導(dǎo)管(BD，瑞典)用于給藥和采血，同時(shí)將22 G導(dǎo)管(BD，瑞典)插入右側(cè)股動(dòng)脈，連接Dash5000壓力傳感器(GE，美國)進(jìn)行連續(xù)血壓監(jiān)測(cè)。器械的平均時(shí)間約為10 min。結(jié)束后靜脈注射2 mg/kg維庫溴銨(輝瑞，美國)。10 min后，將大鼠隨機(jī)分為3組各15只：(1)嗎啡組，在誘導(dǎo)窒息性心搏驟停前10 min靜脈注射5 mg/kg嗎啡；(2)氟比洛芬酯組，在窒息性心搏驟停前10 min靜脈注射5 mg/kg氟比洛芬酯；(3)對(duì)照組，在窒息性心搏驟停前10 min注射等量生理鹽水。

1.3窒息性心搏驟停誘導(dǎo)及數(shù)據(jù)記錄 窒息性心搏驟停誘導(dǎo)方法為：塞住氣管導(dǎo)管8 min，直至平均動(dòng)脈壓(MAP)<20 mmHg。心肺復(fù)蘇方法為：靜脈注射腎上腺素(0.02 mg/kg)，然后進(jìn)行機(jī)械通氣(80次/min)和手動(dòng)胸外按壓(180次/min)，自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)為MAP>60 mmHg，通氣則一直維持到大鼠開始出現(xiàn)自主呼吸。使用加熱墊將直腸體溫保持在36.5～37.5℃。

術(shù)前和心肺復(fù)蘇開始后10 min采動(dòng)脈血，MAP記錄的時(shí)間為基線，靜脈注射藥物或生理鹽水后，窒息性心搏驟停誘導(dǎo)后的1、2、3、4、5 min及復(fù)蘇后第1、5、10、15、20 min，同時(shí)記錄大鼠死亡的數(shù)量和時(shí)間。所有存活大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后注射180 mg/kg硫噴妥鈉處死。

1.4神經(jīng)元免疫組化和生化標(biāo)志物測(cè)定 大鼠死后立即取腦組織，用4%甲醛在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中即刻固定。將石蠟包埋的腦組織切成5 μm切片進(jìn)行免疫組化染色，從每個(gè)腦組織樣本中隨機(jī)選取海馬心搏驟停1區(qū)和皮質(zhì)區(qū)4個(gè)視野(放大40倍)進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。另一部分組織在-70℃下快速冷凍儲(chǔ)存。測(cè)定的血清腦神經(jīng)標(biāo)志物包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和S100鈣結(jié)合蛋白(S100)B，測(cè)定組織標(biāo)志物caspase-3水平，并歸一化為腦組織樣本中的蛋白濃度。所有標(biāo)志物使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(MyBioSource，美國)進(jìn)行測(cè)定。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和Western印跡分析 根據(jù)說明書，使用Trizol溶液(Invitgen，美國)從海馬和大腦皮層提取總RNA。用不含核糖核酸酶的DNase Ⅰ去除DNA污染，使用Prime Script RT Master Mix(TaKaRa，中國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用SYBR PreMix Ex Taq Mix(中國，TaKaRa)通過實(shí)時(shí)PCR(Bio-Rad，美國)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。過氧化物酶增殖激活受體-γ共激活子(PGC)-1α、轉(zhuǎn)錄因子(NRF)-1、NRF-2、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)和肌動(dòng)蛋白(內(nèi)對(duì)照)的特異性引物為：PGC-1α正向:5′-AATGCAGCGGTCTTAGCACT-3′；反向：5′-TTTCTGTGGGTTTGTGTGA-3′;NRF-1正向:5′-TGGTCCAGAGAGTGCTTGTG-3′；反向：5′-TGGT-CCAGAGA GTGCTTGTG-3′;NRF-2正向:5′-CTCGC-TGGAAAAAGAAGTGG-3′；反向：5′-CCGTCCAGGA-GTTCAGAGAG-3′;肌動(dòng)蛋白正向:5′-AACTCCATCATGAAGTGTGACG-3′；反向：5′-GATCCACATCTGCT-GGAAGG-3′。RT-PCR反應(yīng)在95℃中保溫2 min，然后在95℃保溫3 s和60℃保溫30 s的條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，采用歸一化為肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)水平的2-ΔΔCt方法測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

腦組織勻漿在放射免疫沉淀分析緩沖液中，裂解產(chǎn)物在4℃下離心(14 000 r/min)30 min。蛋白質(zhì)樣品(每個(gè)約40 μg)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)60 min后，用PGC-1α(Cell Signaling Technology，1∶1 000稀釋度)、NRF2(Santa Cruz，1∶1 000稀釋度)和α-tubulin (Cell Signaling Technology，1∶5 000稀釋度)的單克隆抗體在4℃孵育過夜。然后，用TBST洗滌3次15 min，然后用辣根過氧化物酶耦聯(lián)二抗(1∶2 000稀釋)在室溫下孵育45 min。用TBST再洗膜3次，并用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Cell Signaling Technology)顯影。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)、Kaplan-Meier檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組實(shí)驗(yàn)過程中MAP變化對(duì)比 在窒息的前3 min，各組MAP都持續(xù)下降，導(dǎo)致窒息性心搏驟停，但氟比洛芬組下降更迅速，在前2 min內(nèi)，氟比洛芬組MAP值顯著低于另外兩組(P<0.05)。在心肺復(fù)蘇開始后5 min內(nèi)，各組均出現(xiàn)ROSC，各組間MAP無顯著差異(P>0.05)。在復(fù)蘇5 min后各組MAP值均開始出現(xiàn)下降，但15 min后氟比洛芬酯組MAP明顯高于其他兩組(P<0.05)。見表1。

2.2各組血液血?dú)庵笜?biāo)、酸堿指標(biāo)和死亡率對(duì)比 基線時(shí)，3組之間血?dú)庾兞俊矂?dòng)脈血氧飽和度(SaO2)、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)〕和酸堿狀態(tài)變量(HCO3、pH和乳酸)沒有明顯差異(P>0.05)，但組內(nèi)與基線水平相比，各組復(fù)蘇后10 min以上各指標(biāo)均有顯著變化(P<0.05)。對(duì)于組間的對(duì)比，大多數(shù)指標(biāo)在3組之間均無顯著差異(P>0.05)，但復(fù)蘇后氟比洛芬酯組PaCO2水平較對(duì)照組和嗎啡組水平顯著降低(P<0.05)，pH值水平較對(duì)照組和嗎啡組顯著升高(P<0.05)。見表2。在整個(gè)復(fù)蘇過程中，所有大鼠只接受室內(nèi)空氣通氣。氟比洛芬酯組生存率〔93.3%(14/15)〕顯著高于對(duì)照組〔46.7%(91/15)〕和嗎啡組〔60.0%(9/15)；P=0.042〕。

2.3各組腦神經(jīng)元損傷情況 免疫組化檢測(cè)心肺復(fù)蘇后大鼠海馬體和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷情況。結(jié)果顯示，皮質(zhì)區(qū)和海馬體區(qū)氟比洛芬酯組活神經(jīng)元數(shù)量〔(17.5±4.9)個(gè)/視野、(23.4±5.2)個(gè)/視野〕明顯多于嗎啡組〔(9.7±1.8)個(gè)/視野、(18.2±4.7)個(gè)/視野〕及對(duì)照組〔(4.8±2.1)個(gè)/視野、(8.7±4.3)個(gè)/視野；P<0.05〕。見圖1。

圖1 各組海馬體和皮質(zhì)神經(jīng)元的變化(IHC染色，×400)

2.4各組大腦損傷標(biāo)志物對(duì)比 與基線比較，各組NSE水平在復(fù)蘇后顯著升高(P<0.05)，但組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；S100B水平在復(fù)蘇后和組間都沒有顯著差異(P>0.05)，caspase-3水平在組間也沒有顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組基線和復(fù)蘇后20min血清NSE和S100B及腦組織caspase-3水平比較

2.5各組線粒體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá) RT-PCR分析顯示，與對(duì)照組比較，氟比洛芬酯組海馬體和皮質(zhì)PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表4。Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，氟比洛芬酯組顯著增加了心肺復(fù)蘇后海馬體和皮質(zhì)PGC-1α和NRF-2的蛋白表達(dá)水平，見圖2、表5。表明氟比洛芬酯處理通過調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生因子mRNA和蛋白的表達(dá)水平來促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生。

圖2 各組心肺復(fù)蘇后腦組織線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 各組腦組織線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

既往窒息性心搏驟停大鼠模型的麻醉方式主要是吸入氟烷和氧化亞氮，但本研究使用的是硫噴妥鈉麻醉，其主要特點(diǎn)在于硫噴妥鈉可以更加顯著地抑制心臟和呼吸功能，使大鼠心肺復(fù)蘇更加困難〔14〕，而硫噴妥鈉帶來的高死亡率與臨床情況更為接近，達(dá)50%〔15〕。但盡管如此，本研究發(fā)現(xiàn)嗎啡和氟比洛芬酯的預(yù)處理可以提高大鼠的早期存活率。對(duì)于阿片類藥物的保護(hù)作用，之前的研究證實(shí)阿片類藥物的預(yù)處理可以顯著提高麻醉大鼠心搏驟停后心功能的恢復(fù)〔16〕；此外與未使用嗎啡預(yù)處理的患者相比，心肺復(fù)蘇之前或期間接受阿片類藥物治療的患者存活率和神經(jīng)學(xué)結(jié)果都有顯著提高〔17〕。本研究也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，其背后的機(jī)制，可能與阿片類藥物提高大鼠對(duì)低氧的耐受有關(guān)。不同的是，之前的研究中嗎啡預(yù)處理會(huì)顯著降低MAP，而本研究嗎啡的預(yù)處理并未導(dǎo)致MAP顯著下降。嗎啡的另一個(gè)顯著效應(yīng)是鎮(zhèn)痛作用，而在心肺復(fù)蘇中，劇烈的胸腔壓迫加上可能的肋骨損傷會(huì)導(dǎo)致存活的患者出現(xiàn)劇烈的疼痛和應(yīng)激反應(yīng)。這可能也是使用嗎啡后的大鼠在心肺復(fù)蘇后存活率高的原因之一。

本研究的新發(fā)現(xiàn)為，經(jīng)氟比洛芬酯預(yù)處理的大鼠心肺復(fù)蘇后的血流穩(wěn)定性和存活率更加提高。顯示出比另外兩組更好的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。這與之前一項(xiàng)研究一致〔18〕。該拮抗劑除了穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)外，還可以顯著減輕大鼠腦水腫現(xiàn)象，而氟比洛芬酯作為一種非甾體抗炎藥物，既往的研究也發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制腦細(xì)胞炎癥，降低腦水腫的發(fā)生〔19〕。因此，氟比洛芬酯的抗炎效應(yīng)和血流動(dòng)力學(xué)的改善可能是本研究中大鼠早期存活率顯著提高的主要原因。

本研究還分析了心肺復(fù)蘇后大鼠腦神經(jīng)的損傷，主要通過血漿NSE、S100B水平和腦組織caspase-3蛋白來體現(xiàn)。NSE和S100B在大腦中的分布不同，但都與缺氧性腦損傷顯著相關(guān)〔20〕。S100B蛋白是一種胞內(nèi)鈣結(jié)合二聚體，分子量低容易穿過血腦屏障進(jìn)入體循環(huán)；NSE廣泛參與神經(jīng)元的葡萄糖代謝，只在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中存在，因此血液中NSE的濃度與神經(jīng)元的破壞相關(guān)〔21〕。本研究中的大鼠在窒息性心搏驟停后20 min沒有發(fā)生細(xì)胞凋亡的跡象，這與預(yù)處理與否無關(guān)。先前對(duì)大鼠大腦神經(jīng)元的研究也發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生窒息性心搏驟停的前6 h內(nèi)，大鼠的大腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)并沒有出現(xiàn)自溶，而9 h后，神經(jīng)元才出現(xiàn)caspase-3的激活〔22〕。因此，本研究中短暫的窒息性心搏驟停沒有對(duì)神經(jīng)元造成廣泛損傷。

線粒體穩(wěn)態(tài)是維持神經(jīng)元功能所必需的，因?yàn)樯窠?jīng)元對(duì)能量的需求很高，而線粒體功能紊亂與神經(jīng)元的失活相關(guān)。輕度的線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，而更廣泛的損傷則導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。因此，線粒體已成為神經(jīng)保護(hù)干預(yù)的重要靶點(diǎn)。心搏驟停和復(fù)蘇后的腦損傷是死亡的常見原因，復(fù)蘇后全身低灌注會(huì)引起的全腦缺血，進(jìn)而引起線粒體功能障礙，如氧化磷酸化的抑制、鈣穩(wěn)態(tài)的破壞、自由基的形成和細(xì)胞死亡信號(hào)通路的激活〔23〕。本研究表明，氟比洛芬可以通過調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生因子的表達(dá)來促進(jìn)心肺復(fù)蘇后腦線粒體的生物發(fā)生，激活促生存激酶蛋白激酶B(AKT/PKB)信號(hào)通路〔24〕。隨后AKT磷酸化NRF-1，促進(jìn)其核定位，并使糖原合成酶激酶(GSK)-3β失活，從而改善NRF-2的核轉(zhuǎn)位，起到保護(hù)神經(jīng)元作用。

本研究還存在一些不足。首先，心輸出量是心肺復(fù)蘇過程中的重要參數(shù)，但限于儀器和實(shí)驗(yàn)條件，本研究未進(jìn)行監(jiān)測(cè)，因此無法了解復(fù)蘇之后氟比洛芬酯對(duì)心臟有無抑制作用。此外，本研究沒有測(cè)量大鼠的大腦需氧量，因此氟比洛芬酯對(duì)耗氧量的影響無法得知。同時(shí)，缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+的快速積累可能會(huì)導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生，因此氟比洛芬酯對(duì)腦水腫的影響有待進(jìn)一步研究。

綜上，使用氟比洛芬酯預(yù)處理可顯著提高大鼠窒息性心搏驟停后的早期存活率，并且對(duì)大鼠腦損傷無明顯影響，血流動(dòng)力學(xué)也更穩(wěn)定，是潛在的心搏驟停預(yù)處理藥物，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來闡明氟比洛芬酯對(duì)復(fù)蘇后的長(zhǎng)期生存和神經(jīng)預(yù)后的影響。