MTSS1及Gli1在食管鱗癌組織中表達及其相關性

何章彪 王翠俠 韓文杰 趙琳 陳奎生

(1商丘醫(yī)學高等?？茖W校五官科，河南 商丘 476100；2商丘市第一人民醫(yī)院腫瘤科；3鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科)

腫瘤轉移抑制基因(MTSS)1是由Lee等〔1〕通過改良的mRNA差異顯示技術在研究膀胱癌轉移機制過程中發(fā)現(xiàn)的一個新基因,該基因定位于人類染色體8q24.1區(qū)域,是一個轉移抑制候選基因，編碼5.3 kb的轉錄產物。膠質瘤相關癌基因蛋白(Gli)1是局域性蛋白質配體(Hh)信號通路的下游轉錄調控因子之一，其表達水平增高標志著Hedgehog信號轉導通路處于激活狀態(tài)，在正常情況中對Hh信號通路起正調控作用〔2〕。有關食管鱗癌組織中MTSS1和 Gli1蛋白表達及其意義尚未見文獻報道。本文采用免疫組化和原位雜交法觀察食管鱗癌組織中MTSS1和Gli1蛋白表達，探討其與食管癌發(fā)生發(fā)展的關系及MTSS1和Gli1的相關性。

1 資料與方法

1.1實驗標本 標本選取商丘市第一人民醫(yī)院2018年6月至2019年12月經病理證實的手術切除新鮮食管鱗狀上皮細胞癌標本，共計136例，男88例，女48例，年齡48～81歲，平均(64±5.1)歲，患者的臨床及病理資料完整，術前均未進行化放療和免疫治療?；颊吆炗喼橥鈺筮M行病理取材，所取標本分別為遠端正常黏膜組織、癌旁3 cm內組織、無壞死癌灶處組織，癌灶區(qū)標本病理證實為食管鱗狀上皮細胞癌。136例癌旁組織中經蘇木素-伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn)有96例為中-重度不典型增生組織。按有無淋巴結轉移分為：轉移組74例和無轉移組62例。所有標本取材后放入10%多聚甲醛固定(在固定液中加入0.1%二乙基焦碳酸酯以抑制RNA酶的活性)，病理標本經常規(guī)脫水、石蠟包埋后4 μm厚連續(xù)切片。對食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織和正常食管黏膜分別進行HE染色、免疫組化和原位雜交染色。

1.2實驗試劑 MTSS1抗體為鼠單克隆抗體，購自美國Abcam公司(ab56780)，工作濃度1∶130 稀釋；Gli1抗體為兔單克隆抗體，購自美國Abcam公司 (ab49314)，工作濃度1∶200稀釋，多聚體分子(Envision)免疫組化試劑盒(二K5007DAB顯色系統(tǒng))購自北京中杉金橋生物技術開發(fā)有限公司；胃蛋白酶、預雜交液及核固紅均購自武漢博士德生物工程有限公司；堿性磷酸酯酶標記(SP-AP)及堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(BCIP/NBT)購自美國Promega公司，MTSS1探針(5′-GGTCCACTGAGCCCCACACATTGTT-3′)，Gli1探針(5′-AGGAGCGGCGGCTGACAGTATAGGC-3′) 由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.3方法

1.3.1標本處理 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織經40 g/L的多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化及原位雜交檢測。

1.3.2免疫組織化學 免疫組化SP法染色步驟按照試劑盒及一抗(濃度為1∶100)說明書要求進行，同時用購自美國Abcam公司(MTSS1和Gli1)的陽性對照片進行陽性對照及用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3.3原位雜交 參照原位雜交試劑盒說明書操作，以不含探針的預雜交液進行雜交及雜交前用核糖核酸酶(RNase)處理樣本作陰性對照〔3,4〕。

1.3.4免疫組化和原位雜交結果判定 在高倍鏡視野下對目標區(qū)域連續(xù)計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞數(shù)占全細胞數(shù)的百分比評分。陽性細胞所占比例<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色深淺評分：樣本無染色為0分；樣本弱染色為1分；樣本中等染色為2分；樣本強染色為3分。將樣本兩者得分相乘記為總分。根據分數(shù)把樣本界定為4類：0～1為陰性(-)，2～4為陽性(+)，5～8為中陽性()，9～12為強陽性()〔3,4〕。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Spearman秩相關分析。

2 結 果

2.1免疫組化與原位雜交結果 MTSS1主要存在于細胞的細胞核/細胞質中，染色呈淡黃至棕黃色。MTSS1 mRNA陽性表達主要存在于細胞核/細胞質中，呈棕紫色顆粒。Gli1主要存在于細胞的細胞質中，染色呈淡黃至棕黃色。Gli1 mRNA陽性表達主要存在于細胞質中，呈棕紫色顆粒。見圖1。

2.2食管鱗癌組織中MTSS1、Gli1的蛋白及mRNA表達 見表1。MTSS1蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中呈低表達，在癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中呈高表達；Gli1蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中呈高表達，在癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中呈低表達，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

圖1 食管鱗癌組織中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA的表達(SP,×400)

表1 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及其正常組織中MTSS1、Gli1蛋白及mRNA表達比較〔n(%)〕

2.3MTSS1及Gli1蛋白表達與食管癌轉移的關系 見表2、表3。有淋巴結轉移的食管鱗癌組織中MTSS1蛋白〔12例(16.2%)〕及mRNA表達〔6例(8.1%)〕均明顯低于無淋巴結轉移的相應組織〔28例(45.2%)、45例(72.6%)〕，Gli1蛋白〔68例(91.9%)vs 47例(75.8%)〕及mRNA表達〔64例(86.5%)vs 21例(34.0%)〕均明顯高于無淋巴結轉移的相應組織(均P<0.05)。

2.4MTSS1和Gli1的相關性分析 食管鱗癌組織中MTSS1蛋白與Gli1蛋白表達呈負相關(r=-0.422，P<0.001)。見表2。食管鱗癌組織中MTSS1 mRNA與Gli1 mRNA表達呈負相關(r=-0.389，P<0.001)。見表3。

表2 食管鱗狀細胞癌組織中MTSS1與Gli1蛋白的表達情況(n)

表3 食管鱗狀細胞癌組織中MTSS1與Gli1 mRNA的表達情況(n)

3 討 論

3.1Hedgehog信號通路與食管鱗癌的關系 Hedgehog信號轉導通路在進化上高度保守并有重要生物學功能。胞膜上的受體 Patched(Ptch1、Ptch2)、胞外配體Hh及跨膜蛋白(Smo)和細胞內部的下游轉錄因子鋅指核轉錄因子Gli蛋白等組成了Hedgehog信號轉導通路〔2〕。Hedgehog通路調控胚胎發(fā)育過程中的細胞分化和增殖。Hedgehog信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，有關文獻報道包括：前列腺癌、皮膚基底細胞癌、胃癌、白血病、小細胞肺癌等惡性腫瘤，在這些報道中提到了發(fā)現(xiàn)該通路存在異常的激活。在Hh通路上任何成員的突變或缺失都可能導致信號傳遞的改變〔3〕。目前已有文獻報道該信號通路的異常激活與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系〔4〕。信號傳導分子Gli在Hh信號通路中起到重要作用，Hh通路末端的轉錄激活因子Gli1蛋白在Hh相關性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著必不可少的作用〔5〕。因此Gli 的表達水平可以作為反映 Hh信號通路活性的一個可靠指標，Gli1表達異?？梢酝ㄟ^多種途徑誘導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲性生長。

本研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織、正常食管黏膜中Gli1的蛋白的表達依次降低，這表明Hh信號通路與食管鱗癌的發(fā)生關系密切，Hh信號通路在食管鱗癌中活化這一觀點得到了支持。通過Gli1蛋白的表達結果和臨床病例資料對比分析顯示，與腫瘤的浸潤程度和有無淋巴結轉移相關，這提示Hh信號通路有可能參與了食管鱗癌的侵襲性生長，可通對Hh信號通路調控來抑制腫瘤的生長。

3.2MTSS1與食管鱗癌的關系 目前對于MTSS1的作用和功能還存在一定的爭議。早期研究〔6〕發(fā)現(xiàn)MTSS1在未轉移的膀胱癌細胞中高表達，在高轉移的膀胱癌細胞株中低表達，這提示在腫瘤侵襲和轉移的過程中MTSS1有可能是一個有抑制能力的蛋白。MISS1可能作用于肌動蛋白細胞骨架，從而抑制癌細胞轉移。但是有學者認為MISS1的低表達和腫瘤的侵襲性轉移相關性有待進一步研究，MTSS1并非都是作為一個轉移抑制因子存在，如Yao等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中MTSS1 mRNA及蛋白上調，且MTSSl是肝癌早期病變的誘導者,寇煒等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)MISS1在膀胱癌中表達下降，但與膀胱癌的侵襲行為無關。張曙光等〔9〕采用免疫組化和RT-PCR等方法研究發(fā)現(xiàn)MTSS1在食管鱗癌組織和細胞低表達，這與本研究結果相一致。本研究提示MTSS1在食管鱗癌的侵襲性生長過程中可能作為一個抑制信號，但是其具體發(fā)揮的作用尚有待進一步研究。

3.3MTSS1在Hedgehog信號通路中的作用 MTSS1自從發(fā)現(xiàn)以來，多數(shù)學者認為其作為一種細胞骨架蛋白，其表達受到信號肽(Shh)的調控〔10〕。Shh作為Hh信號通路中的一種重要的信號肽，在哺乳動物中廣泛表達，控制著不同類型祖細胞的比表達。Shh可以通過下游Gli信號分子控制細胞的生長、增值和分化，同時也參與了腫瘤細胞的增殖和擴散〔11〕。作為Shh通路上的相關基因MTSS1能夠協(xié)同Gli轉錄從而激活Shh途徑的轉錄〔12〕。在眾多Gli的啟動基因中，在多種組織系統(tǒng)中MTSS1可以促使其轉錄。MTSS1、Gli1/Gli2及Gli相關蛋白細胞內調控組分(Sufu)三者合成三元絡合物，Gli介導的轉錄受到促進，進一步促進了成瘤和瘤體生長過程及腫瘤細胞增殖與侵襲〔13〕。所以MTSS1可能是Shh的一個靶基因，通過Shh途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前有關Hedgehog信號通路的研究，以該通路對腫瘤發(fā)生及瘤體生長的作用居多，但最近有關肝癌、卵巢癌、胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，過度活化的通路也會促進腫瘤的侵襲性生長和轉移〔14〕。但MTSS1在該通路中如何促進腫瘤的生長、侵襲和轉移的機制尚不明確。

本研究將食管鱗癌組織中MTSS1的表達和Hedgehog信號通路中重要的信號分子Gli1的表達對比分析顯示，其蛋白表達呈現(xiàn)負相關。但在食管鱗癌的發(fā)生遷移過程中，MTSS1是否參與Hedgehog信號的表達調控及Hedgehog信號通路是否參與了食管鱗癌的侵襲性生長和遷移尚不甚明了。在食管鱗癌中，MTSS1的表達調控有可能和Hedgehog信號通路中的某些分子存在相互抑制作用，也有可能MTSS1只是在一定階段或一定濃度下對 Hedgehog信號通路其調控作用，這些問題都有待于進一步討論研究。