九龍蟲對(duì)不同生長(zhǎng)期自然衰老小鼠睪丸凋亡因子及血清相關(guān)激素的影響

潘朝旺 王偉 謝耀峰 江鈴興 金法明 秦玲麗 楊家林 周先云

(1湖北省鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 鄂州 436000；2鄂州市中心醫(yī)院；3武漢市第二衛(wèi)生學(xué)校；4 武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

衰老指機(jī)體對(duì)環(huán)境的生理和心理適應(yīng)能力進(jìn)行性降低、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象，作為生命活動(dòng)的基本現(xiàn)象，在衰老過(guò)程中，始終伴隨著機(jī)體器官功能的退化，實(shí)驗(yàn)表明，衰老動(dòng)物也伴隨著生殖系統(tǒng)功能的減退〔1,2〕，因而尋找和開發(fā)具有抗衰老功能的中藥也成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)之一。前期研究提示九龍蟲具有抗衰老作用〔3,4〕，本實(shí)驗(yàn)旨在研究九龍蟲對(duì)不同時(shí)期自然衰老小鼠血清黃體生成素(LH)、睪酮(T)及睪丸凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9的影響，探討其對(duì)抗衰老機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物 九龍蟲散，本院自制，按比例加入動(dòng)物飼料中；維生素E軟膠丸(20180618，青島雙鯨藥業(yè)有限公司。

1.2動(dòng)物 清潔級(jí)KM小鼠，雄性，3月齡30只，9月齡150只，動(dòng)物合格證號(hào)：42000600015619，許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-0018，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.3試劑 LH、T酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(購(gòu)自南京卡米洛生物工程有限公司)、Caspase-3、9 ELISA試劑盒(購(gòu)自凱基生物科技公司)。

1.4儀器 9602A酶標(biāo)儀(南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器公司)、UV754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)。

1.5動(dòng)物分組給藥 取9月齡KM小鼠150只，隨機(jī)分為5組，即九龍蟲低、中、高劑量組、模型組、維生素E組，每組30只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1個(gè)月后，給予含藥飼料喂養(yǎng)，飼料用量為每天7 g/只，含藥飼料是在普通飼料里加入藥物，其中九龍蟲低、中、高劑量組分別含九龍蟲散0.004 8%、0.009 6%、0.019 2%，模型組為不含藥的普通飼料，維生素E組含0.010 3%維生素E，分別在小鼠月齡為14、18、22月后，取血清和睪丸，每批每組10只，共3批，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。另相應(yīng)分批取3月齡KM小鼠30只，作為青年組，每批10只，同以上3批小鼠一起取血清和睪丸，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.6一般狀態(tài)觀察 觀察大鼠毛色、活動(dòng)等一般情況，分3批斷頭取血，再取睪丸，稱重，計(jì)算睪丸臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=睪丸重量/小鼠體重×100%)。

1.7ELISA檢測(cè)血清LH、T 取上述血清，嚴(yán)格按LH、T試劑盒說(shuō)明進(jìn)行LH、T含量的測(cè)定。

1.8ELISA檢測(cè)睪丸Caspase-3、Caspase-9 取睪丸，用生理鹽水1∶20勻漿，按試劑盒說(shuō)明書操作:加樣→洗滌→加入抗體工作液→洗滌→加酶標(biāo)抗體工作液→洗滌→加入底物工作液→加終止液→用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值,Caspase活性計(jì)算方法：Caspase活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/青年組OD平均值)×100%。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般狀態(tài)觀察及對(duì)睪丸臟器系數(shù)的影響 隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組小鼠一般情況逐漸變差，毛色光澤逐漸減弱，活動(dòng)逐漸減少，但各給藥組精神狀態(tài)較模型組明顯要好。14月齡時(shí)，與青年組和模型組比較，各組小鼠睪丸臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；18月齡時(shí)，與模型組比較，青年組和九龍蟲高劑量組睪丸臟器系數(shù)明顯增大(P<0.05)，其他各組睪丸臟器系數(shù)也有所增大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；22月齡時(shí)，與模型組比較，青年組、維生素E組和九龍蟲中、高劑量組睪丸臟器系數(shù)明顯增大(P<0.05，P<0.01)，九龍蟲低劑量組睪丸臟器系數(shù)也有所增大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；22月齡時(shí)，與青年組比較，維生素E組和九龍蟲中、低劑量組睪丸臟器系數(shù)明顯減小(P<0.05，P<0.01)，九龍蟲高劑量組睪丸臟器系數(shù)也有所減小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組血清LH、T比較 14月齡時(shí)，與模型組比較，各組小鼠血清LH降低、血清T升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；18月齡時(shí)，與模型組比較，各組血清LH降低、血清T升高，其中青年組和九龍蟲高劑量血清LH、T差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，其他各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與青年組比較，九龍蟲低劑量組血清LH明顯升高；22月齡時(shí)，與模型組比較，各組血清LH降低、血清T升高，除九龍蟲低劑量血清T差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；22月齡時(shí)，與青年組比較，維生素E組和九龍蟲中、低劑量組血清LH明顯升高、血清T明顯降低(P<0.05，P<0.01)，九龍蟲高劑量組血清LH升高、血清T降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見(jiàn)表2。

2.3各組對(duì)睪丸Caspase-3、Caspase-9比較 14月齡時(shí)，與青年組比較，模型組睪丸Caspase-3、Caspase-9升高，與模型組比較，各組小鼠睪丸Caspase-3、Caspase-9降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；18月齡時(shí)，與模型組比較，各組睪丸Caspase-3、Caspase-9降低，其中青年組和九龍蟲高劑量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，其他各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；22月齡時(shí)，與模型組比較，各組睪丸Caspase-3、Caspase-9降低，除九龍蟲低劑量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；22月齡時(shí)，與青年組比較，維生素E組和九龍蟲各劑量組睪丸Caspase-3、Caspase-9明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表3。

3 討 論

衰老是機(jī)體正常的生理現(xiàn)象，隨著年齡增長(zhǎng)，睪丸呈現(xiàn)退行性變。下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)睪丸的生殖功能具有調(diào)節(jié)作用，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH) 調(diào)控著垂體LH 的分泌，而LH可促進(jìn)Leydig 細(xì)胞合成和分泌雄性激素T〔5,6〕，激發(fā)生精過(guò)程，同時(shí)促進(jìn)精子成熟，對(duì)生精過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用。T是啟動(dòng)和維持精子發(fā)生的重要激素，臨床上常用T水平判斷睪丸的生精功能；T可促進(jìn)生精細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育，抑制生精細(xì)胞凋亡〔7〕。

細(xì)胞凋亡因子與衰老也有著密切的關(guān)系〔8,9〕，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主有序死亡過(guò)程,Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，有幾種在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)揮重要作用，其中Caspase-9參與了細(xì)胞凋亡的起始,Caspase-3則參與了細(xì)胞凋亡的執(zhí)行?；罨腃aspase-9可作為上游凋亡始動(dòng)因子，激活下游的凋亡效應(yīng)因子Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；Caspase-3 同時(shí)可進(jìn)一步促進(jìn)上游Caspase-9活化，加速細(xì)胞凋亡〔10，11〕。Caspase-3被激活，凋亡就進(jìn)入不可逆的過(guò)程，一般認(rèn)為Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，Caspase-3最主要的底物是腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，該酶與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)。在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，116 kD 的PARP被Caspase-3剪切成31 kD和85 kD兩個(gè)片段，使PARP中與DNA結(jié)合的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能，結(jié)果使受PARP負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡。

綜上，九龍蟲可通過(guò)降低血清LH和睪丸組織Caspase-3、Caspase-9水平，升高血清T水平，延緩小鼠睪丸衰老進(jìn)程。