NGF聯(lián)合抗VEGF對(duì)糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜組織中氧化應(yīng)激和VEGF表達(dá)的影響

孫鵬 孟巖 張劍 齊艷秀 劉宏偉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病是嚴(yán)重影響人們健康的一種慢性代謝性疾病，日益受到國內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。在糖尿病所有類型中，2 型糖尿病最為多見，占所有病例的90%以上〔1〕。糖尿病眼病是由糖尿病引起的一類眼部并發(fā)癥的總稱，其中最典型的是糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)，它是導(dǎo)致患者視力下降、受損甚至失明的主要原因〔2〕。糖尿病眼病的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，諸多血管刺激和抑制因子在其演進(jìn)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)因其具有顯著的促血管生成作用，故其在糖尿病眼病病理過程中的作用備受人們關(guān)注〔3〕。有關(guān)研究報(bào)道，在糖尿病眼病的演進(jìn)過程中，可檢測到VEGF表達(dá)和水平的增加，但對(duì)于糖尿病眼病的各時(shí)間段VEGF水平的具體情況沒有進(jìn)行深入探討〔4〕。在糖尿病的模型制備中，目前人們主要以大鼠為研究對(duì)象，通過注射鏈脲佐菌素(STZ)來促使其發(fā)展為糖尿病模型〔5〕。本研究利用STZ誘導(dǎo)大鼠構(gòu)建糖尿病模型，并利用神經(jīng)生長因子(NGF)和抗VEGF進(jìn)行干預(yù)后，觀察大鼠血清血糖和VEGF的變化，檢測大鼠視覺電生理視網(wǎng)膜暗反應(yīng)(ERG)，并研究大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激水平和VEGF含量，以明確抗VEGF藥物對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的防治作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)(SPF)8周齡健康雄性Wistar大鼠(體重210～250 g)80只(長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司)，分籠(5只/籠)飼養(yǎng)。動(dòng)物采用自由飲水?dāng)z食飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：空氣相對(duì)濕度50%～70%，環(huán)境溫度19～22℃，明暗交替光照周期為12 h/12 h。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 鏈佐霉素(美國Sigma公司)；水合氯醛(廣州市醫(yī)藥公司)；VEGF一抗(武漢博士德公司)；二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋公司)；MP150生理記錄儀(美國BioLab公司)；組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；石蠟切片機(jī)、展片機(jī)(德國Leica公司)；恒溫水浴箱(北京長安科學(xué)儀器廠)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和模型建立 將大鼠隨機(jī)平均分為正常對(duì)照組、模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組各10只。正常對(duì)照組給予正常飲食，其他3組給予高脂高糖飲食。持續(xù)4 w后，進(jìn)行造模，造模前先禁食24 h，然后模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組腹腔注射STZ(50 mg/kg)，正常對(duì)照組則腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液。造模72 h后，采集尾靜脈血檢測空腹血糖(FBG)，F(xiàn)BG≥16.7 mmol/L為模型制備成功。

1.4給藥 誘導(dǎo)糖尿病模型后繼續(xù)飼養(yǎng)至16 w，待模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變后，進(jìn)行如下給藥處理：NGF組在肌肉和眼球玻璃體腔內(nèi)分別注射NGF和生理鹽水，NGF+抗VEGF組兩部位分別注射NGF和抗VEGF藥物，而正常對(duì)照組兩部位則注射生理鹽水，連續(xù)給予3 w。

1.5大鼠房水中VEGF和FBG含量檢測 各組實(shí)驗(yàn)大鼠尾靜脈取血測FBG，眼球房內(nèi)取房水采用VEGF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(AE98006Ra，上海聯(lián)碩生物科技有限公司)測VEGF水平。

1.6ERG檢查 大鼠暗適應(yīng)1 h以上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.3 g/kg體重。麻醉狀態(tài)的大鼠固定于大鼠實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，右眼滴加復(fù)方托吡卡胺滴眼液(美多麗)散瞳，滴加鹽酸奧布卡因滴眼液(倍諾喜)表面麻醉。將記錄電極、參考電極和接地電極分別與右眼角膜表面、兩眼間和尾部進(jìn)行連接。用MP150生理記錄儀進(jìn)行ERG記錄，反應(yīng)光強(qiáng)為0.38 cd·s/m2。檢測結(jié)束后，點(diǎn)氯霉素眼藥水以預(yù)防感染。

1.7視網(wǎng)膜組織中丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測 將實(shí)驗(yàn)大鼠視網(wǎng)膜組織進(jìn)行充分研磨，并制備成10%組織勻漿液。常溫進(jìn)行離心(2 000 r/min)后，收集上清液，用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和可見光分光光度計(jì)測定各組視網(wǎng)膜組織中MDA、CAT和SOD含量變化。

1.8免疫組化檢測VEGF蛋白表達(dá) 將切片進(jìn)行烤片30 min；常規(guī)脫蠟、入水、抗原修復(fù)、封閉后，用抗VEGF抗體(稀釋比為1∶50)在4℃孵育過夜；用二步法免疫組化檢測試劑盒操作后，進(jìn)行DAB顯色；浸入蘇木素染液5 s進(jìn)行復(fù)染，然后浸入1%HCl/酒精30 s進(jìn)行分化；蒸餾水徹底沖洗后，置于自來水中放置2 h；常規(guī)脫水、透明、封片后利用圖像采集系統(tǒng)采集并分析結(jié)果。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組房水中VEGF水平和FBG比較 各組注射3 w后，與正常對(duì)照組相比，其余3組VEGF水平、FBG明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，NGF組和 NGF+抗VEGF組VEGF水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組房水中VEGF和FBG比較

2.2各組ERG檢查 各組注射3 w后，與正常組比較，模型組、NGF組ERG檢查b波潛伏期顯著延遲(P<0.05)，振幅明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，NGF組和 NGF+抗VEGF組ERG檢查b波潛伏期顯著縮短(P<0.05)，振幅明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組ERG潛伏期和幅值變化

2.3各組視網(wǎng)膜組織中MDA、CAT和SOD含量檢測 各組注射3 w后，與正常對(duì)照組相比，模型組MDA含量明顯升高、CAT和SOD含量明顯降低(P<0.05)；模型組比較，NG組和NGF+抗VEGF組MDA、CAT、SOD含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組視網(wǎng)膜中MDA、CAT和SOD含量測定

2.4各組VEGF蛋白表達(dá) 由免疫組化結(jié)果所見，VEGF主要表達(dá)于內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。與正常對(duì)照組相比，VEGF在模型組、NGF組和 NGF+抗VEGF組的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，VEGF在NGF組和NGF+抗VEGF組的蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)；與NGF組相比，VEGF在NGF+抗VEGF組的表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組眼球視網(wǎng)膜中VEGF蛋白檢測(免疫組化，×400)

3 討 論

隨著DR發(fā)病率程逐年上升的趨勢，DR的防治已成為糖尿病并發(fā)癥研究領(lǐng)域中迫在眉睫的重要課題。建立可復(fù)制性、合理性和可靠性的動(dòng)物模型是深入研究DR發(fā)病機(jī)制、評(píng)判藥物治療效果及制定防治、防御措施的重要環(huán)節(jié)之一。DR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立是否可行、可靠和穩(wěn)定及其與人類DR的類似度，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。經(jīng)典的糖尿病動(dòng)物模型主要包括以下4類，分別為化學(xué)物質(zhì)(如STZ和四氧啼唆)誘導(dǎo)動(dòng)物模型、自發(fā)性遺傳性動(dòng)物模型、胰腺部分切除動(dòng)物模型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型〔6〕。STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型一直備受科研人員的推崇，其具有對(duì)大鼠周圍組織毒性小，模型死亡率低、穩(wěn)定性高，模型建立簡便易行、操作程序簡化等特點(diǎn)。STZ是一種專門選擇性破壞動(dòng)物胰島β細(xì)胞的藥物，其作用是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮(NO)實(shí)現(xiàn)的。在體內(nèi)，NO具有參與自由基級(jí)聯(lián)反應(yīng)、抑制線粒體功能、β細(xì)胞代謝和胰島素分泌等作用，結(jié)果可使FBG升高〔7〕。然而，STZ對(duì)視網(wǎng)膜則沒有毒性作用。目前認(rèn)為，利用STZ注射建立糖尿病動(dòng)物模型的使用劑量沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，小劑量多次注射STZ可成功建立糖尿病動(dòng)物模型，該方法與糖尿病發(fā)生發(fā)展的自然病程相近，能使胰島功能發(fā)生漸進(jìn)性損傷，且可有效降低模型動(dòng)物的死亡率。此外，有研究認(rèn)為，雌性鼠建立糖尿病動(dòng)物模型的成功率較雄性鼠更低，其原因與雌激素對(duì)血管具有保護(hù)作用有關(guān)〔10〕。基于此，本課題選用雄性大鼠作為研究對(duì)象。

針對(duì)視網(wǎng)膜電生理的研究，劉文舟等〔11〕的研究結(jié)果顯示，DR患者ERG的a、b波振幅(尤其是b波的振幅)改變敏感。在DR早期，當(dāng)眼底未發(fā)生病理改變時(shí)，就可檢測到ERG異常。ERG可敏感并客觀反映出視網(wǎng)膜內(nèi)層血液循環(huán)的狀態(tài)。尤其是在DR患者住院的前期已經(jīng)出現(xiàn)Ops總波振幅降低并伴有子波振幅選擇性降低的現(xiàn)象〔12〕。所以，Ops波在DR患者早期診斷和治療效果評(píng)價(jià)有著不可替代的重要價(jià)值〔13〕。目前認(rèn)為，DR早期病變中即可出現(xiàn)Ops總波幅變化，提示其是DR早期診斷敏感的指標(biāo)之一〔14〕。此外，Ops還可反映視網(wǎng)膜損害的情況，沈泓等〔15〕研究表明，Ops 總波振幅與DR病情成反比，與許建華等〔16〕發(fā)表的結(jié)論一致。DR的出現(xiàn)再一次證明糖尿病患者的病程已經(jīng)發(fā)展到不可逆的階段，眼部周圍的微環(huán)境已經(jīng)受到了破壞。隨著患者病程期的延續(xù)和患者血液里FBG值持續(xù)的升高，DR出現(xiàn)的概率會(huì)更大〔17〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF蛋白表達(dá)對(duì)糖尿病眼病的發(fā)生和發(fā)展過程起到了重要作用，因糖尿病眼病患者的玻璃體VEGF濃度高，可能與玻璃體為矯治物體相關(guān)，可利于VEGF 的濃縮及儲(chǔ)存〔18〕。在視網(wǎng)膜中分泌VEGF后，滲入玻璃體中儲(chǔ)存。而房水中VEGF是在睫狀突形成后，經(jīng)后房循環(huán)，從小梁網(wǎng)進(jìn)入房水靜脈內(nèi)，經(jīng)房水中循環(huán)，從而形成 VEGF 水平上升〔19〕。已經(jīng)有學(xué)者研究顯示〔20〕，玻璃體VEGF水平上升，是導(dǎo)致糖尿病患者出現(xiàn)玻璃體DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。VEGF為最新檢查出的新生血管生長因子，其具有較強(qiáng)的促分裂能力〔21〕。眼睛未出現(xiàn)病變時(shí)，視網(wǎng)膜周邊細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均會(huì)形成較低的 VEGF，已經(jīng)有學(xué)者研究表示〔22〕，VEGF在糖尿病眼病發(fā)展中具有重要作用。相較于未出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變患者，視網(wǎng)膜病變組的 VEGF 水平明顯較高，且與血清胰島素樣生長因子(IGF)-1、胰島素抵抗呈密切相關(guān)性，在不同眼部疾病房水中，VEGF濃度同樣存在差異。研究結(jié)果顯示〔23〕，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者，慢性閉角型青光眼患者及新生血管性青光眼患者VEGF水平均有明顯差異(P<0.05)。在正常情況下，組織中VEGF表達(dá)水平較低，而當(dāng)組織血供豐富且代謝旺盛時(shí)，VEGF 水平將相應(yīng)升高，同樣，在病理?xiàng)l件下，其表達(dá)也會(huì)升高。

綜上，在2型糖尿病患者DR中，VEGF 水平明顯上升，IGF-1 水平隨之上升，呈相互影響關(guān)系〔24〕。隨著我國科研工作者和世界上科研人員對(duì)糖尿病眼病的發(fā)病機(jī)制不斷深入的研究，對(duì)糖尿病眼病患者的治療技術(shù)和方法也會(huì)可獲得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。