基于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路探究N-乙酰半胱氨酸對肺氣腫大鼠的干預(yù)效果

拉周措毛 德毛措

(1青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；2青海省海南州人民醫(yī)院)

肺氣腫是由支原體病原菌感染所造成，是急性呼吸感染類病癥的一種，伴隨當(dāng)下患肺氣腫人口基數(shù)不斷上升，其發(fā)病、預(yù)防已變成全球公共健康問題〔1,2〕。作為治療肺氣腫的常用藥物，N-乙酰半胱氨酸對治療肺氣腫引起的呼吸急促癥狀、肺部病灶組織、信號通路有優(yōu)良的藥理作用，同時也是國內(nèi)治療肺氣腫的優(yōu)等藥物〔3～5〕。本研究基于Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化因子(MyD)88/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路，探討N-乙酸半胱氨酸對肺氣腫大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取60只SPF級雄性大鼠，購自成都岐黃博恩生物科技有限公司，動物許可證號：SYXK(川)2020-225，8～10周齡，平均體重(253.77±25.96)g，于濕度28%～35%、溫度(21.73±1.76)℃下，培養(yǎng)10 d，給予持續(xù)光照18 h/d。本研究操作已獲醫(yī)院倫理委員會審批同意，且嚴(yán)格參照動物實驗倫理要求相關(guān)規(guī)定進行。主要試劑：人胎盤脂多糖注射液由湖南一格制藥有限公司提供(國藥準(zhǔn)字：S43020003，規(guī)格：12 ml)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒及有關(guān)試劑由江西艾博因生物科技有限公司提供，生理鹽水由艾美捷科技有限公司提供，兔抗人TLR4由武漢益普生物科技有限公司提供，小鼠抗大鼠MyD88/NF-κB由上海梵態(tài)生物科技有限公司提供。N-乙酰半胱氨酸片(海南贊邦制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20080326，規(guī)格：600 mg)。

1.2分組和建模 按照整群隨機法將60只SPF級大鼠分為對照組、模型組、N-乙酰半胱氨酸低劑量組、高劑量組各15只，對照組不采取任何操作，正常喂養(yǎng)，模型組、N-乙酰半胱氨酸低劑量組、高劑量組均依據(jù)馬鳳萍等〔6〕研究構(gòu)建肺氣腫大鼠模型，各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后采用熏煙結(jié)合氣管內(nèi)滴注脂多糖的方法進行造模。分別兩次向大鼠氣管內(nèi)滴注脂多糖0.2 ml/只(1 mg/ml)，將模型組、N-乙酰半胱氨酸低劑量組、高劑量組大鼠置于自制熏煙箱內(nèi)熏煙，2次/d，每日11時、17時各點燃1次熏煙箱，每次熏煙數(shù)量12支(山東將軍牌卷煙)。熏煙期間保證供給各組相同的食物、飲水，灌注脂多糖注射液后將大鼠仰臥位固定，旋轉(zhuǎn)固定板使脂多糖均勻分布兩肺。建模成功表現(xiàn)：觀察建模過程中模型組、N-乙酰半胱氨酸低劑量組、高劑量組大鼠癥狀，是否符合肺氣腫病理表現(xiàn)，即在建模過程中，隨著時間推移，與對照組比較，模型組、N-乙酰半胱氨酸低劑量組、高劑量組大鼠開始出現(xiàn)活動量慢慢減少，喜蜷縮，撮毛，毛發(fā)缺少光澤、逐漸枯黃且容易脫落，喘息氣促，呼吸表淺，偶爾可聽見氣道有轆轆水聲。煙熏周期慢慢增加后，除對照組外，其余各組上述癥狀逐漸加重，且體重較對照組明顯減輕，表明大鼠肺功能減退，符合肺氣腫病理表現(xiàn)。

1.3藥品干預(yù)方法 N-乙酰半胱氨酸低劑量組灌胃給予N-乙酰半胱氨酸片100 mg，3次/d，N-乙酰半胱氨酸高劑量組灌胃給予N-乙酰半胱氨酸片200 mg，3次/d，對照組、模型組等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥2 w。

1.4樣本采集 各組采集靜脈血5 ml，之后隨機選用各組3只大鼠，常規(guī)麻醉處死收集大鼠肺部臟器組織，分為3份，2份存于液氮內(nèi)，以待后續(xù)指標(biāo)檢驗，1份用于制備切片檢驗。

1.5大鼠肺組織肺氣腫相關(guān)征象 提取肺部臟器組織并實施脫蠟、切片、脫水措施，且用蘇木素-伊紅(HE)對肺部臟器切片進行染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察其組織結(jié)構(gòu)。采用肺組織病理半定量法，分析其平均肺泡面積(MAA)、肺泡平均內(nèi)襯間隔(MLI)指標(biāo)。

1.6肺功能相關(guān)指標(biāo)水平檢測 采用動物肺功能檢測儀(安徽電子科學(xué)研究所)檢測各組大鼠肺功能相關(guān)指標(biāo)。隨機選用各組2只大鼠麻醉、消毒、切開頸部皮膚，使其氣管呈倒T形切開，使用食道插管經(jīng)口插入大鼠食道中部，連接壓力傳感器記錄采集信號，處死大鼠。通過肺功能分析系統(tǒng)(MPA)分析得出各組氣道阻力(AR)、肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)，峰流速值(PEF)水平，并取平均值。

1.7檢驗?zāi)[瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6指標(biāo) ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平，實驗過程：樣本采集、保存參照1.4；提前30 min取出西卡林試劑盒(SIKARU，加拿大)，放置室溫；將濃縮洗滌液以1∶30的比例用雙蒸水稀釋；配制酶結(jié)合物工作液，用試劑稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1∶100)產(chǎn)生酶結(jié)合物工作液；打開試劑盒，將試劑稀釋液混合樣本添加于西卡林試劑盒酶標(biāo)板孔中，放置10 min，觀察數(shù)值并記錄樣本濃度；將不同濃度樣本加入樣本孔中，在每個樣本孔中加入5 μl樣本稀釋液和樣本，再依次加入50 μl生物素化抗體工作液，使用封板膠紙密封反應(yīng)孔，放置30 min，讀取數(shù)值；清洗酶標(biāo)板孔5次，使洗滌液350 μl置入每孔，等待1.35 min后清理孔內(nèi)液體，用吸水紙干燥；使用普卡自動微粒免疫器(PUKEI 日本)再次測驗樣本TNF-α、IL-1β、IL-6濃度并記錄；對TNF-α、IL-1β、IL-6指標(biāo)進行測驗，95℃、5 min；60℃、持續(xù)30 s，共進行30個循環(huán)，室溫處理30 min廢棄液體，使用洗液清洗5次，3 min/次，遺棄廢液；每孔加90 μl底物溶液，室溫處理20～25 min，每孔加入50 μl終止溶液，終止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀上450 nm波長下調(diào)節(jié)、讀取指標(biāo)數(shù)值。

1.8檢驗肺部病灶組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路指標(biāo) 采用Western印跡檢測TLR4、MyD88、NF-κB信號通路指標(biāo)。先選用存儲在液氮內(nèi)的肺部病灶組織，收集其組織總蛋白，采集38 μg蛋白質(zhì)，經(jīng)電泳90 min后，傳送到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，于24℃下，實行封閉操作，再向其加1∶1 500的洗滌緩沖液(TBST)提供給稀釋后的TLR4信號通路一抗，使用濃度為0.08%辣根過氧化氫酶標(biāo)識MyD88/NF-κB二抗，于27℃下進行操作。在避光環(huán)境下，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色30 min，然后采用凝膠成像分析軟件(LABWORK)，進行掃描操作，獲取膠片，計算TLR4、MyD88、NF-κB信號通路指標(biāo)。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織肺氣腫相關(guān)征象對比 對照組肺部細胞基質(zhì)整齊排列、形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)明顯；模型組肺部細胞基質(zhì)排列參差不齊，出現(xiàn)重度氣球樣變形、壞死；N-乙酰半胱氨酸低劑量組肺部細胞基質(zhì)排列不整齊，出現(xiàn)重度浮腫，局部的氣球樣變形、壞死；N-乙酰半胱氨酸高劑量組肺部細胞基質(zhì)排列參差不齊，出現(xiàn)輕度浮腫，細胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)較為明顯。與對照組相比，其余3組MAA、MLI顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，N-乙酰半胱氨酸低劑量組及高劑量組MAA、MLI顯著降低(P<0.05)；與N-乙酰半胱氨酸低劑量組相比，N-乙酰半胱氨酸高劑量組MAA、MLI顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 各組肺部病灶組織病理學(xué)觀察(HE染色，×400)

2.2各組肺功能相關(guān)指標(biāo)對比 與對照組相比，其余3組AR明顯升高、Cdyn、PEF明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，N-乙酰半胱氨酸低劑量組及高劑量組AR明顯降低、Cdyn、PEF明顯升高(P<0.05)；與N-乙酰半胱氨酸低劑量組相比，N-乙酰半胱氨酸高劑量組AR明顯降低，Cdyn、PEF明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平對比 與對照組相比，其余3組IL-1β、TNF-α水平顯著降低，IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，N-乙酰半胱氨酸低劑量組及高劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著升高，IL-6水平顯著降低(P<0.05)；與N-乙酰半胱氨酸低劑量組相比，N-乙酰半胱氨酸高劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著升高，IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.4各組肺部病灶組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路指標(biāo)對比 與對照組相比，其余3組TLR4、MyD88、NF-κB信號通路指標(biāo)顯著升高(P<0.001)；與模型組相比，N-乙酰半胱氨酸低劑量組及高劑量組TLR4、MyD88、NF-κB信號通路指標(biāo)顯著降低(P<0.05)；與N-乙酰半胱氨酸低劑量組相比，N-乙酰半胱氨酸高劑量組TLR4、MyD88、NF-κB信號通路指標(biāo)顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2。

3 討 論

研究認為，肺氣腫目前已經(jīng)成為臨床上研究的熱點，是一類高發(fā)生率病癥，其發(fā)生與多種因素共同作用相關(guān)〔7～10〕。雖然診治肺氣腫的手段技術(shù)在不斷提高，肺氣腫的診治方案也在不斷改善，可其造成的病痛傷害是不可逆的〔11〕。肺氣腫的特點是早期沒有癥狀，極其不易被發(fā)現(xiàn)和忽略，易發(fā)生慢性阻塞性肺疾病等并發(fā)癥〔12〕。

據(jù)研究報道〔13～15〕，N-乙酰半胱氨酸是一種治療肺氣腫的高效率藥品，呈現(xiàn)植物蒜氣味，乳白片劑，作為抑制肺氣腫的優(yōu)良藥品，已在中國肺氣腫臨床使用上有悠久的歷史。研究認為〔16～18〕，N-乙酰半胱氨酸在肺氣腫里的作用機制是其與抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞、抑制呼吸與氨基酸、糖和蛋白質(zhì)代謝中間產(chǎn)物的氧化和脫氫有關(guān)，通過抑制核酸及蛋白質(zhì)合成，抑制病原菌生長。N-乙酰半胱氨酸還可抑制肺部急劇感染，修復(fù)氣道壁穩(wěn)態(tài)細胞基質(zhì)，繼發(fā)感染狀態(tài)下，N-乙酰半胱氨酸也可抑制肺部黏膜異常。通過這種手段N-乙酰半胱氨酸使肺部病灶組織細胞基質(zhì)生長環(huán)境優(yōu)良，抑制病原菌生長異常。N-乙酰半胱氨酸能第一時間作用于肺部病灶組織，極大地增加了肺氣腫的診斷效能。由此本研究推測，N-乙酰半胱氨酸治療后各項指標(biāo)均優(yōu)化，診斷效能較高。

TNF-α、IL-1β、IL-6指標(biāo)常被用于評估肺氣腫的病情，TNF-α是肺氣腫檢驗中一項重要的檢測方式，TNF-α具有維持肺部病灶組織細胞基質(zhì)運轉(zhuǎn)的作用〔19〕。IL-1β在治療肺氣腫過程中，數(shù)值大小影響治療效果成效，是治療過程中不可或缺的重要指標(biāo)〔20〕。IL-6是肺氣腫的一道天然生物屏障，當(dāng)其數(shù)目過多會使炎性細胞在氣道外積聚，產(chǎn)生肺氣腫癥狀。故而尋找能控制肺氣腫的相關(guān)基因表達，且及時調(diào)控分管細胞的信號通路，具有重大意義。治療肺氣腫離不開此兩項指標(biāo)，其作為監(jiān)測肺氣腫的關(guān)鍵指標(biāo)，在肺氣腫的治療上起到顯著輔助作用，同時也提升了肺氣腫的診斷性能。

有研究認為〔21〕，信號通路分布于各種細胞中，包含了線粒體基質(zhì)、內(nèi)外膜。信號通路在內(nèi)膜中作用于電子傳遞鏈聚集部位，而外膜主要作用是分泌離子通道蛋白。信號通路主要通過氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量，進而為細胞進行各種生命活動。TLR4、MyD88、NF-κB信號通路調(diào)控發(fā)生肺氣腫最為特別，三者互相協(xié)調(diào)，從而達成修復(fù)氣道內(nèi)膜、肺部病灶組織黏膜的作用〔22〕。其將受損的細胞基質(zhì)修復(fù)，形成自噬體，最終降解于溶酶體，TLR4、MyD88、NF-κB信號通路如果表達異常，會致線粒體出現(xiàn)障礙，從而更易發(fā)生肺氣腫癥狀〔23〕。TLR4一般表達在病原菌表面，而MyD88一般表達在肺部病灶組織細胞基質(zhì)表面，TLR4、MyD88、NF-κB信號通路表達升高能促進病原體感染情況下免疫逃逸，因而判定TLR4、MyD88、NF-κB信號通路能降低肺部病灶組織中細胞基質(zhì)炎性效應(yīng)功能，成為肺氣腫病原菌的一種逃逸方式。NF-κB能降低細胞基質(zhì)的活化功能，進而影響肺氣腫的治療進展。3種信號通路影響著肺氣腫的進程，其指標(biāo)異常易患肺氣腫。本研究顯示，TLR4、MyD88、NF-κB信號通路對肺氣腫耐受機制提供了細胞基質(zhì)極性作用判斷，對肺氣腫的治療、聯(lián)合治療具有重要意義。但本研究存在一定的狹隘性，應(yīng)多做大樣本、多中心分析，預(yù)防、減少N-乙酰半胱氨酸治療肺氣腫出現(xiàn)的不良因素。

綜上，治療肺氣腫使用N-乙酰半胱氨酸效果明顯，優(yōu)化病灶組織細胞基質(zhì)表達，有效緩解臨床癥狀，促進細胞基質(zhì)免疫功能恢復(fù)，抗炎反應(yīng)明顯改善，安全性很高。