黃杞總黃酮對(duì)慢性心力衰竭大鼠AT1/CARP信號(hào)通路及心肌自噬的影響

解娜 王建發(fā) 楊秀麗 殷國(guó)田 趙國(guó)安

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

心力衰竭(HF)是由心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病引起的心室充盈和/或射血功能受損所致〔1〕。血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。AT1激活了幾種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在沒有高血壓的情況下，AT1局部過表達(dá)也可能促成心肌肥大的發(fā)病機(jī)制〔2〕。心肌錨定重復(fù)蛋白(CARP)為人內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α)誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄輔因子〔3，4〕。研究表明，CARP既是核轉(zhuǎn)錄的輔助因子，又是肌小節(jié)Ⅰ帶中與肌動(dòng)蛋白相關(guān)的伸展感覺復(fù)合體的組成部分，參與肌原纖維的組裝和伸展感覺。動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)肥厚型心肌細(xì)胞中CARP的表達(dá)顯著上調(diào)。在因擴(kuò)張型心肌病，局部缺血性心臟病和心律失常性右室心肌病導(dǎo)致代償性HF的患者中也觀察到相同現(xiàn)象〔5〕。在生理?xiàng)l件下，自噬可以清除心肌細(xì)胞中的衰老細(xì)胞器和受損的蛋白質(zhì)，以維持心臟功能和心臟形狀，在心臟病中，自噬水平的改變也可能導(dǎo)致受損的線粒體積聚，從而影響心臟功能〔6〕。黃杞總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化和消除自由基作用，黃杞總黃酮參與了磷酸與花生四烯酸的代謝、蛋白質(zhì)的磷酸化、鈣離子的轉(zhuǎn)移、自由基的清除、抗氧化活力的增強(qiáng)、氧化還原作用、螯合作用和基因的表達(dá)〔7〕。黃杞總黃酮具有抗炎癥、抗過敏、抑制細(xì)菌、抑制寄生蟲、抑制病毒、防治肝病、防治心血管疾病、防治血管栓塞、防治心與腦血管疾病、抗腫瘤、抗化學(xué)毒物的療效〔8〕。本研究擬探討黃杞總黃酮對(duì)慢性HF大鼠AT1/CARP信號(hào)通路及心肌自噬的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2019-0011，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(渝)2019-0013，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：NC00190346；雌雄不限，10～12周齡，體重220～300 g。大鼠在12∶12 h的明暗周期中飼養(yǎng)，并飼喂標(biāo)準(zhǔn)飲食和純凈水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2主要藥物、試劑及儀器 黃杞總黃酮(原料藥，純度≥98%，南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)SW30117)；纈沙坦片(北京諾華制藥有限公司，規(guī)格40 mg/片，批號(hào)20190811)；細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G0170-100T、FS-14993)；TRIzol試劑(北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司，批號(hào)LGTZ001)；第一鏈cDNA合成試劑盒(艾美捷科技有限公司，批號(hào)NGB-54400)；SYBR Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(凱杰生物工程深圳有限公司，批號(hào)208059)；蛋白質(zhì)提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)SF2672-25、P0006)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(德國(guó)默克密理博公司，批號(hào)SVLP04703)；AT1單克隆抗體、CARP單克隆抗體、β-肌動(dòng)蛋白(actin)單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)sc-22006、sc-53566、sc-0016)；羊抗鼠二抗(上海中科英沐生物科技有限公司，批號(hào)PB001F7)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)YK-10P2)；GE 730型彩色多普勒超聲診斷儀(美國(guó)通用電氣公司)；BX53TR型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；E100型光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)；7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國(guó)ABI公司)；Tanon 5200型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3動(dòng)物建模及給藥 將72只大鼠通過戊巴比妥鈉腹膜麻醉，于胸骨左緣第3、4肋間開胸，暴露心臟，使用6.0無創(chuàng)縫合線用于結(jié)扎左前降支(LAD)冠狀動(dòng)脈(距左心耳和肺動(dòng)脈椎體之間的主動(dòng)脈根3～4 mm)?？p合胸壁后發(fā)現(xiàn)共8只大鼠死亡，且術(shù)后1 w，行心臟彩超檢測(cè)，當(dāng)左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<45%視為慢性心力衰竭大鼠模型制備成功〔6〕。共成功造模64只大鼠，將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分成4組：模型組、纈沙坦組〔9〕(50 mg/kg)、黃杞總黃酮低、高劑量組(250、500 mg/kg)〔7〕，每組16只。另取16只無任何處理措施的大鼠為對(duì)照組。纈沙坦組、黃杞總黃酮低、高劑量組于建模成功后第1天，給予相應(yīng)藥物灌胃，灌胃體積10 ml/kg，對(duì)照組及模型組灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥4 w。

1.4超聲心動(dòng)指標(biāo)的測(cè)定 使用彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行超聲檢查，使用二維超聲心動(dòng)圖顯示左心室的長(zhǎng)軸，測(cè)量與心臟功能相關(guān)的參數(shù)，如左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左心室短軸縮短率(FS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.5心肌自噬指數(shù)的測(cè)定 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，并將其頸椎脫臼處死，剝離心臟，獲取心肌組織。常規(guī)制作心肌組織切片，MDC法測(cè)定細(xì)胞自噬水平。操作如下：將切片用PBS洗滌5 min兩次后，向每個(gè)切片中加入0.05 mmol/L MDC，在37℃的保護(hù)下避光孵育1 h，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，將載玻片固定在用PBS洗滌并固定后在4%多聚甲醛中放置15 min。通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)酸性自噬小體(綠色)，說明細(xì)胞發(fā)生自噬。每個(gè)標(biāo)本捕獲5張圖像，記錄心肌細(xì)胞和自噬細(xì)胞的總數(shù)并計(jì)算平均值。自噬指數(shù)的計(jì)算公式如下：自噬指數(shù)=自噬細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6大鼠心肌病理結(jié)構(gòu)觀察 將心肌組織制備石蠟切片(5 m/片)，采用HE試劑盒染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7qRT-PCR測(cè)定心肌組織AT1、CARP mRNA水平 TRIzol試劑從大鼠心肌組織提取總RNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR Kit試劑盒進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。引物由碧云天生物技術(shù)研究所合成。AT1引物正向5′-GTTCTGGAATTGCGTGCTTT-3′，反向5′-TGCTTCATGAGCCAAGTCAC-3′；CARP引物正向5′-TTGATGTCCAGCTGAGTYCCT-3′，反向5′-CTTGAAGGGATCGCTCATGT-3′。β-actin用作內(nèi)部對(duì)照，β-actin引物正向5′-TGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3′、反向5′-TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。循環(huán)程序如下：95℃ 2 min，然后在95℃變性持續(xù)5 s 30個(gè)循環(huán)，在56℃退火30 s，在68℃延伸30 s。PCR總反應(yīng)體積為20 μl，包含10 μl SYBR Green PCR Kit，0.8 μl正向引物，0.8 μl反向引物，2 μl cDNA模板和6.4 μl ddH2O。采用2-ΔΔCt法計(jì)算AT1、CARP mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8Western印跡測(cè)定心肌組織AT1、CARP蛋白水平 將心肌組織樣品裂解30 min，并使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白，通過Bradford試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，隨后將等量的蛋白質(zhì)(20 μg)加載到聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的每個(gè)泳道上，電泳在80 V(堆積凝膠)/ 120 V(分離凝膠)的恒定電壓下進(jìn)行，將蛋白質(zhì)樣品電印跡到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，然后加入AT1、 CARP、β-actin一抗(均為1∶1 000)在4℃下孵育過夜。加入羊抗鼠二抗(1∶5 000)與膜在室溫下孵育1 h，通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行觀察。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取結(jié)果，計(jì)算AT1、 CARP蛋白和β-actin蛋白(作為內(nèi)部對(duì)照)的密度比，作為相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs升高，F(xiàn)S、EF降低(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組、黃杞總黃酮低高劑量組LVIDd、LVIDs明顯降低，F(xiàn)S、EF明顯升高；且黃杞總黃酮高劑量組LVIDd、LVIDs明顯低于黃杞總黃酮低劑量組，F(xiàn)S、EF明顯高于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組LVIDd、LVIDs升高，F(xiàn)S、EF降低(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組LVIDd、LVIDs、FS、EF與纈沙坦組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠心肌細(xì)胞自噬情況比較 與對(duì)照組〔(8.96±3.54)%〕比較，模型組大鼠自噬指數(shù)水平明顯升高〔(56.96±4.29)%,P<0.05〕。與模型組比較，纈沙坦組〔(21.63±4.99)%〕、黃杞總黃酮低劑量組〔(41.63±5.96)%〕、黃杞總黃酮高劑量組〔(20.47±5.87)%〕自噬指數(shù)水平明顯降低，且黃杞總黃酮高劑量組自噬指數(shù)水平明顯低于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組自噬指數(shù)水平明顯升高(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組自噬指數(shù)水平與纈沙坦組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞自噬顯微觀察(甲基綠染色，×400)

2.3各組大鼠心肌組織病理結(jié)構(gòu)比較 對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)正常；模型組心肌橫紋紊亂，心肌細(xì)胞明顯腫脹，出現(xiàn)空泡情況(箭頭所示)，肌纖維溶解明顯，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；纈沙坦組及黃杞總黃酮高劑量組心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，心肌纖維排列整齊；黃杞總黃酮低劑量組心肌仍有明顯病理變化。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理(HE染色，×400)

2.4各組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組、黃杞總黃酮低、高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯降低；且黃杞總黃酮高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯低于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平與纈沙坦組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖3。

表2 各組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平比較

1～5：對(duì)照組，模型組，纈沙坦組，黃杞總黃酮低劑量組，黃杞總黃酮高劑量組圖3 各組大鼠心肌組織AT1、CARP蛋白表達(dá)

3 討 論

黃杞總黃酮是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇，其他包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等。由于黃杞總黃酮分子量小，可被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，具有保護(hù)血管、防動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能〔10，11〕。黃杞總黃酮可有效清除體內(nèi)的氧自由基，黃杞總黃酮可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種阻止氧化的能力是維生素E的10倍以上，這種抗氧化作用可以阻止心肌細(xì)胞的自噬〔12〕。此外，黃杞總黃酮可改善血液循環(huán)，降低膽固醇，這些作用大大降低了心腦血管疾病的發(fā)病率，也可改善心腦血管疾病的癥狀〔13〕。本研究說明，黃杞總黃酮對(duì)慢性HF大鼠心功能機(jī)心臟病理改變有明顯保護(hù)作用，這與上述討論一致。

心臟在病理情況下，隨著內(nèi)部環(huán)境和應(yīng)力條件的變化(例如缺乏能量、氧化損失和線粒體膜通透性過渡孔的開放)，心肌細(xì)胞自噬將相應(yīng)增強(qiáng)。研究表明，自噬對(duì)于維持心臟功能至關(guān)重要，心肌細(xì)胞自噬水平的升高可引起細(xì)胞器功能障礙，例如線粒體鈣離子的積累〔14〕。本研究說明，黃杞總黃酮能明顯降低心肌細(xì)胞自噬水平，進(jìn)而保護(hù)慢性HF大鼠心功能。

AT1通過作用于心肌細(xì)胞的特定受體誘導(dǎo)心臟重構(gòu)，AT1是G蛋白耦聯(lián)受體家族成員，血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大主要由AT1介導(dǎo)。Ang Ⅱ的正性變力和變力作用會(huì)增加耗氧量〔15〕。AT1激活特定的酪氨酸激酶途徑并引起酪氨酸磷酸化，然后激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白酪氨酸激酶(JAK)。JNK可以通過培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中的Ang Ⅱ通過AT1激活〔16〕。ERK是促分裂原活化蛋白激酶家族的關(guān)鍵成員，與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大密切相關(guān)。JAK/轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)途徑是與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大密切相關(guān)的另一種途徑，它不同于促細(xì)胞分裂劑激活的蛋白激酶家族〔17〕。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧的H9C2細(xì)胞及缺血/再灌注(I/R)期間的大鼠心肌中AT1表達(dá)持續(xù)升高。在阿霉素誘導(dǎo)的心肌病心肌中也觀察到AT1表達(dá)升高，與心肌細(xì)胞自噬和細(xì)胞丟失有關(guān)。最近的研究表明，AT1可能加重Ang Ⅱ或壓力超負(fù)荷引起的心肌細(xì)胞自噬〔18〕。越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞自噬發(fā)生在各種心血管疾病中，包括肥厚性心肌病，缺血性心臟病和充血性心力衰竭。心肌細(xì)胞自噬促進(jìn)心臟疾病的發(fā)展和進(jìn)程，是重要的治療靶點(diǎn)〔19〕。研究發(fā)現(xiàn)CARP在大鼠胚胎心臟H9C2細(xì)胞中表達(dá)，與DNA損傷基因153(GADD153)基因密切相關(guān)，并受到缺氧的雙重調(diào)控，GADD153過表達(dá)加重H9C2細(xì)胞自噬，而CARP表達(dá)隨之下調(diào)；還顯示出CARP通過抑制ERK1/2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑來減輕心肌肥大，而與心肌細(xì)胞自噬無關(guān)〔20〕。CARP還作為核轉(zhuǎn)錄輔因子，已被證明對(duì)心臟基因表達(dá)和心臟形態(tài)發(fā)生負(fù)調(diào)控。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了CARP在受缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷的培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中均下調(diào)，它們都是公認(rèn)的自噬模型〔21〕。本研究結(jié)果提示，黃杞總黃酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，進(jìn)而抑制AT1 CARP信號(hào)通路的激活，從而抑制心肌自噬。

綜上，黃杞總黃酮對(duì)慢性HF大鼠心肌功能及心臟病理改變有明顯保護(hù)作用，能明顯降低心肌細(xì)胞自噬水平；其機(jī)制可能與黃杞總黃酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，進(jìn)而抑制AT1/CARP信號(hào)通路的激活有關(guān)。