地氟烷對老年大鼠海馬Aβ、Tau蛋白表達(dá)及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

龔濤武 趙鵬程 吳振宇 楊洋 朱宇航 張超 朱昭瓊

(1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563000；2貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3遵義醫(yī)科大學(xué)麻醉醫(yī)學(xué)院)

地氟烷作為一種新型鹵代吸入麻醉劑，具有起效快、蘇醒迅速和可控性強(qiáng)的特點(diǎn)，在臨床上得到廣泛應(yīng)用〔1〕。目前，我國接受手術(shù)的老年患者日趨增多，鑒于地氟烷的藥理特點(diǎn)，其在老年患者的麻醉使用具有明顯的優(yōu)勢，但有關(guān)地氟烷在老年患者中應(yīng)用是否會(huì)造成患者術(shù)后發(fā)生記憶能力的損害報(bào)道較少。因此，本研究擬借助動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)蛋白的研究，評價(jià)地氟烷對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 地氟烷(批號(hào)：H094F622)；無水乙醇(無錫展望)；磷酸鹽緩沖液(PBS，無錫菩禾)；5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(無錫菩禾)；抗原修復(fù)液(Beyotime)；Hochest染色(Beyotime)；Morris 水迷宮測試儀(成都泰盟科技有限公司)；Fabius麻醉機(jī)；Vamos氣體監(jiān)護(hù)儀(Draeger公司，德國)；倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司型號(hào)1X71)；吸入麻醉箱(自制)；恒溫培養(yǎng)箱(ABI-7500)；β-淀粉樣蛋白(Aβ，Abcam)；Tau蛋白(武漢三鷹)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 20月齡健康雄性SD老年大鼠25只，體重450～550 g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SCXK(渝)2012-0005〕。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(C組，n=5)和實(shí)驗(yàn)組(n=20)，其中實(shí)驗(yàn)組分為4個(gè)亞組即麻醉后蘇醒2 h(D-2)組、12 h(D-12)組、24 h(D-24)組、72 h(D-72)組，每組5只。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 水迷宮實(shí)驗(yàn)開始前1 d，所有大鼠先行Morris水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練，剔除不會(huì)游泳的大鼠。定位航行實(shí)驗(yàn)(5 d)：設(shè)置平臺(tái)與水面距離為2 cm，每只大鼠每天訓(xùn)練4次。大鼠分別于東、南、西、北4個(gè)象限中點(diǎn)面向池壁入水，限定大鼠在120 s內(nèi)找到并爬上平臺(tái)休息10 s，若120 s內(nèi)未找到，則引導(dǎo)其找到并置于平臺(tái)上休息10 s，記錄逃避潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)(1 d)：第6天移除平臺(tái)，將所有大鼠從第四象限入水，游泳120 s，記錄有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間、有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)。Morris水迷宮訓(xùn)練完成后，C組于自制吸入麻醉箱中吸入1 L/min空氣+1 L/min O230 min；實(shí)驗(yàn)組均吸入8%地氟烷30 min。C組、D-2組在分別吸入1 L/min空氣+1 L/min O2和8%地氟烷30 min后完全蘇醒2 h行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)并取材；D-12組、D-24組、D-72組于地氟烷麻醉完全蘇醒后12、24、72 h再次行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)并取材。

1.4免疫熒光檢測海馬Aβ、Tau蛋白 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，各組大鼠于各時(shí)間點(diǎn)分別腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉生效后處死，取海馬組織石蠟包埋切片，待切片干燥后復(fù)水；抗原修復(fù)：將切片浸泡在抗原修復(fù)液中；過氧化物酶滅活：H2O2室溫孵育；封閉；孵育一抗：將Tau和Aβ按1∶100稀釋后滴加至組織上37℃ 2 h；孵育二抗：將兔二抗按1∶100稀釋后滴加至組織上37℃ 1 h；染核：將Hochest染色液滴加至組織上室溫15 min；脫水；在切片上滴加封片液(甘油和抗猝滅劑1∶1混合)；蓋上蓋玻片，封片；顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)結(jié)果 麻醉前逃避潛伏期與總路程隨著時(shí)間的推移逐漸縮短，第2～5天逃避潛伏期及總路程均顯著短于第1天(P<0.01，P<0.05)，見表1。

表1 大鼠水迷宮訓(xùn)練逃避潛伏期與總路程

麻醉后各組有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間、有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 麻醉后各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

2.2海馬內(nèi)Tau、Aβ蛋白表達(dá)比較 大鼠海馬內(nèi)Tau、Aβ蛋白的表達(dá)量各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3、圖1。

表3 各組海馬Tau、Aβ蛋白表達(dá)比較

圖1 免疫熒光法檢測各組大鼠海馬Aβ、Tau蛋白的表達(dá)(Hochest，×100)

3 討 論

有關(guān)術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，研究已經(jīng)表明，年齡是POCD的眾多影響因素中唯一明確的危險(xiǎn)因素，接受大手術(shù)治療的老年患者POCD的發(fā)生率為30%～40%，部分患者可持續(xù)至3個(gè)月〔2〕，鑒于此，本次研究選擇的研究對象為老年大鼠。

Morris水迷宮常應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究，現(xiàn)已成為阿爾茨海默病基礎(chǔ)研究中評價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典方法〔3〕。海馬是腦內(nèi)具有學(xué)習(xí)和記憶功能的重要結(jié)構(gòu)，當(dāng)大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)元接收到各種知覺和感官訊息時(shí)，其會(huì)迅速將訊息傳遞給海馬，海馬損傷將導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損。過度磷酸化的Tau蛋白在腦內(nèi)形成各種沉積物，沉積在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，引起神經(jīng)元損害、變性。Aβ蛋白能在細(xì)胞基質(zhì)中沉積并具有神經(jīng)毒性，可激活小膠質(zhì)細(xì)胞等促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，破壞神經(jīng)系統(tǒng)。研究結(jié)果顯示，Aβ過度沉積和Tau蛋白過度磷酸化是各種原因誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶下降的共同通路〔4,5〕。

有關(guān)地氟烷麻醉對學(xué)習(xí)記憶能力是否造成影響報(bào)道不一致〔6～8〕。本研究根據(jù)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇8%地氟烷為研究使用濃度〔9〕。

本研究結(jié)果提示，老年大鼠吸入8%的地氟烷麻醉30 min后，學(xué)習(xí)記憶能力未出現(xiàn)下降。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過對各實(shí)驗(yàn)組的大鼠海馬內(nèi)Aβ、Tau蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，在各組大鼠海馬和大腦皮層區(qū)域的Aβ、Tau蛋白表達(dá)高，其他部位表達(dá)近乎于無，與對照組相比較，各組間的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢，但差異不明顯，表明大鼠海馬內(nèi)Aβ、Tau蛋白的表達(dá)盡管出現(xiàn)一定量的增加，但不足以對老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力造成損害。Callaway等〔10〕的研究表明地氟烷對學(xué)習(xí)記憶能力的損害呈現(xiàn)劑量和年齡依耐性，老年大鼠在吸入最低有效肺泡濃度的地氟烷4 h，1 w后測試其學(xué)習(xí)記憶能力沒有損害，與本研究結(jié)果一致。而與文獻(xiàn)〔11〕的報(bào)道研究結(jié)果不一致，可能為研究使用的吸入藥物濃度和麻醉時(shí)間不同所導(dǎo)致。

綜上所述，使用地氟烷短時(shí)間麻醉影響大鼠海馬內(nèi)Aβ、Tau蛋白的表達(dá)增加，但未造成老年大鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力下降。有關(guān)地氟烷在認(rèn)知功能方面的影響仍需進(jìn)一步廣泛且深入地開展相關(guān)研究，從而更好地為臨床提供數(shù)據(jù)支持。