針灸對(duì)自然衰老圍絕經(jīng)期大鼠雌激素水平及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

權(quán)興苗 王月 宋春俠 范麗潔 時(shí)菁靜 劉玉蘭 徐立偉

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，河北 承德 067000；2河北中醫(yī)學(xué)院)

圍絕經(jīng)期綜合征(PMS)是由于生理或病理引起機(jī)體發(fā)生變化導(dǎo)致卵巢損傷或功能衰竭，使雌激素分泌減少，導(dǎo)致組織發(fā)生變化的退行性病變〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，神經(jīng)遞質(zhì)、激素和細(xì)胞因子失衡是PMS發(fā)生的主要原因，機(jī)體雌激素水平下降，影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成，可引發(fā)腦組織損傷，增加圍絕經(jīng)期抑郁癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。PMS的病因復(fù)雜，目前臨床通常采用雌激素替代療法治療PMS，但長(zhǎng)期使用雌激素會(huì)增加子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)〔3，4〕。針灸治療在神經(jīng)和免疫等方面對(duì)全身具有宏觀調(diào)控作用，具有安全、無痛、高效、快捷和適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)〔5〕。目前采用針灸治療自然衰老圍絕經(jīng)期的機(jī)制研究尚淺，本研究主要通過自然衰老大鼠作PMS模型，觀察針灸刺激雙側(cè)腎俞、三陰交和神門對(duì)大鼠腦組織去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(HT)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平的影響，探討針灸療法對(duì)圍絕經(jīng)期的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12～14月齡雌性SD大鼠30只，體重(300±20)g，陰道細(xì)胞涂片連續(xù)15 d監(jiān)測(cè)未發(fā)現(xiàn)動(dòng)情期變化，根據(jù)陰道分泌物和細(xì)胞學(xué)變化顯示大鼠符合圍絕經(jīng)期變化規(guī)律〔6〕。同時(shí)選取健康4～6月齡雌性SD大鼠10只作為對(duì)照組，體重(220±20)g，均由河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院提供，合格證號(hào)：SYXK(冀)2014-0033。飼養(yǎng)室溫(22±2)℃，濕度65%，自由攝食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2主要試劑和儀器 E2、FSH、LH放射免疫分析試劑盒購(gòu)自上海滬震生物科技有限公司；NE、DA和5-HT標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CKX53倒置生物顯微鏡(廠家：日本Olympus公司)；e2695型高效液相色譜儀(廠家：美國(guó)Waters公司)；life2720型PCR熱循環(huán)儀(廠家：美國(guó)ABI公司)；DYCZ-30C型雙板夾芯式垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3動(dòng)物分組和給藥 將30只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組和治療組。將大鼠束縛，治療組根據(jù)大鼠穴位圖譜取雙側(cè)腎俞、三陰交和神門，腎俞位于第二腰椎后兩旁，左右各一，刺入背闊肌、骼肋肌溝內(nèi)，直刺6 mm；三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上方1 cm，左右各一，刺入趾身屈肌，直刺5 mm；神門位于前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣，左右各一，刺入腕尺側(cè)屈肌，之刺1 mm〔7〕；留針20 min，隔天1次，共15次，其余各組不進(jìn)行刺激，但處理包括捆綁、脫毛等與實(shí)驗(yàn)組相同。陽性對(duì)照組灌胃給予尼爾雌醇1.5 mg/kg，1 d/次。其余各組給予等量生理鹽水，1 d/次，連續(xù)4 w。

1.4曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)測(cè)定行為學(xué)變化 OFT 取大鼠置于安靜房間曠場(chǎng)反應(yīng)箱(100 cm×100 cm×40 cm)，內(nèi)壁涂黑，底面平均劃分小格。記錄大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)3 min 內(nèi)穿越底面格數(shù)(四爪均進(jìn)入方格方可計(jì)數(shù))的水平活動(dòng)得分(穿越1格計(jì) 1分，沿線行走每8 cm 計(jì)1分)及后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁)的垂直活動(dòng)得分(雙前足離地1次為1分)。

1.5大鼠卵巢組織蘇木素-伊紅(HE)染色 處死大鼠后摘取卵巢組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，片厚5 μm，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.5%鹽酸乙醇分化2 s，伊紅染色5 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織黃體、卵泡和卵泡膜細(xì)胞等結(jié)構(gòu)及形態(tài)學(xué)變化。

1.6放射免疫分析法測(cè)定E2、FSH和LH水平 各組大鼠末次治療后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血4 ml，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心5 min，分離血清，測(cè)定E2、FSH和LH水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照放射免疫分析試劑盒說明書方法進(jìn)行。

1.7單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定 處死大鼠后迅速取腦，稱重，加入2 ml 0.1 mol/L HClO4溶液，制作腦組織勻漿，于4℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。另取NE、DA和5-HT對(duì)照品適量，采用HPLC-ECD法測(cè)定混合對(duì)照品溶液峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取供試品溶液進(jìn)樣，計(jì)算含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組OFT水平及垂直運(yùn)動(dòng)得分比較 給藥前，與對(duì)照組比較，模型組水平及垂直活動(dòng)得分明顯下降(P<0.05)。給藥后，與模型組比較，陽性對(duì)照組和治療組水平及垂直活動(dòng)明顯增加(P<0.05)；陽性對(duì)照組和治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組水平及垂直活動(dòng)得分比較分)

2.2各組卵巢組織形態(tài)學(xué)變化情況 對(duì)照組卵巢組織黃體發(fā)育良好，體積較大，可見多個(gè)成熟卵泡。模型組卵巢組織黃體數(shù)目少，成熟卵泡少，閉鎖卵泡較多，表現(xiàn)為卵巢萎縮。陽性對(duì)照組和治療組可見成熟卵泡，卵巢萎縮現(xiàn)象明顯改善。見圖1。

圖1 各組卵巢組織HE染色結(jié)果(×400)

2.3各組單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較 與對(duì)照組比較，模型組腦組織NE和DA含量明顯降低，5-HT含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對(duì)照組和治療組腦組織NE和DA含量明顯升高，5-HT含量明顯降低(P<0.05)；陽性對(duì)照組和治療組腦組織NE、DA和5-HT含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組單胺類神經(jīng)遞質(zhì)HPLC圖

表2 各組血清NE、DA和5-HT含量比較

2.4各組性激素水平比較 與對(duì)照組比較，模型組血清E2水平明顯降低，血清FSH和LH水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對(duì)照組和治療組血清E2水平明顯升高(P<0.05)，血清FSH和LH水平均明顯降低(P<0.05)；陽性對(duì)照組和治療組E2和FSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LH水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組血清E2、FSH和LH水平比較

3 討 論

PMS在中醫(yī)范疇里屬于絕經(jīng)前后諸證，認(rèn)為是由于陰血虧虛，腎水不足，導(dǎo)致腎臟陰陽平衡失調(diào)引起病變〔8〕。腎為沖任之本，腎陰虛則精虧血少，腎陽虛則虛寒內(nèi)生，對(duì)此，本研究通過刺激腎俞和三陰交，達(dá)到壯元陽，助運(yùn)化的目的。腎俞穴歸屬足太陽膀胱經(jīng)，有補(bǔ)腎助陽、調(diào)節(jié)生殖功能；三陰交屬足太陰脾經(jīng)，為足三陰經(jīng)之匯，是調(diào)理肝脾腎的要穴，針灸二穴能夠補(bǔ)肝益腎，調(diào)和營(yíng)血〔9〕。神門系心氣出入之門，為手少陰心經(jīng)之腧穴，原穴，針灸神門可開心氣，安定神智〔10〕。采用針灸刺激可激活相應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)控下丘腦-內(nèi)分泌，繼而影響靶器官。

卵巢是女性的性腺器官，具有排卵和產(chǎn)生雌激素、孕激素及雄激素的功能，卵巢功能衰退是圍絕經(jīng)期婦女卵巢分泌卵泡數(shù)量減少、性激素合成不足、血清雌激素水平下降的主要原因，激素水平下降會(huì)導(dǎo)致下丘腦和垂體等神經(jīng)功能衰退，引起內(nèi)分泌失調(diào)〔11，12〕。雌激素中以E2的活性最高〔13〕。在機(jī)體病理狀態(tài)下E2分泌減少，會(huì)促進(jìn)腺垂體和釋放促性腺激素合成，引起內(nèi)分泌功能紊亂，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境異常，其中促性腺激素包括FSH和LH〔14〕。FSH具有促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育及生殖細(xì)胞成熟〔15〕，LH具有促進(jìn)黃體酮分泌的作用〔16〕。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化受到激素水平的影響，二者存在相關(guān)關(guān)系〔17〕，因此圍絕經(jīng)期婦女更容易出現(xiàn)心理疾病。本研究結(jié)果說明自然衰老大鼠血清雌激素分泌減少，會(huì)導(dǎo)致下丘腦-垂體-卵巢軸之間平衡失調(diào)，促進(jìn)FSH及LH分泌。另外說明針灸刺激雙側(cè)腎俞、三陰交和神門，能夠通過下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)自然衰老圍絕經(jīng)期模型大鼠雌激素水平。此外，針灸刺激以上穴位能夠刺激機(jī)體調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，起到一定抗抑郁作用。

綜上，針灸雙側(cè)腎俞、三陰交和神門，能夠調(diào)節(jié)自然衰老圍絕經(jīng)期模型大鼠雌激素水平，調(diào)節(jié)腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，改善圍絕經(jīng)期引起的抑郁行為。