基于45S rDNA-FISH的異源三倍體‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體行為追蹤*

王律幾 張曉曉 王 君

(北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室 林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100083)

植物三倍體在減數(shù)分裂過程由于復(fù)雜的染色體聯(lián)會(huì)，往往出現(xiàn)染色體不平衡分離、染色體落后甚至丟失等高度異常的染色體行為，對(duì)配子育性造成嚴(yán)重影響(Sergioetal., 1999； Asano, 1982； Limetal., 2000)。在百合(Liliumbrownii)、矮牽牛(Petuniahybrida)、黃瓜(Cucumissativus)等植物的三倍體物種小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I均有單價(jià)體、二價(jià)體和三價(jià)體共存的現(xiàn)象(封紫等， 2012； 魏躍等， 2020； 刁衛(wèi)平等， 2009)。呂曄等(2018)在三倍體‘贊皇大棗’(Ziziphusjujuba‘Zanhuang Dazao’)小孢子母細(xì)胞中觀察到一定比例落后染色體、微核、姊妹染色單體提前分離等現(xiàn)象，這些異常的染色體行為可能導(dǎo)致配子遺傳物質(zhì)缺失。然而，對(duì)于整體染色體行為的觀察已不滿足植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究的發(fā)展需要，探討特定染色體在減數(shù)分裂過程中的行為更具研究價(jià)值。隨著分子細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展，熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescenceinsituhybridization, FISH)可實(shí)現(xiàn)染色體的識(shí)別和定位，逐漸被應(yīng)用于植物減數(shù)分裂過程染色體行為的研究。Zhao等(2019)利用FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)二倍體黃瓜雜種(HC，2n= 2x= 19)存在H染色體組非同源染色體間發(fā)生配對(duì)現(xiàn)象，且異源四倍體黃瓜(Cucumis×hytivus, HHCC，2n= 4x= 38)的H染色體組比C染色體組具有更高頻的單價(jià)體和落后染色體。在甘蔗與斑茅草雜交種(Saccharumofficinarum×Erianthusarundinaceus)中5S rDNA所在染色體在減數(shù)分裂過程中分離不平衡，導(dǎo)致四分體子核中可能存在2～5個(gè)信號(hào)，并且在第二次減數(shù)分裂過程中發(fā)現(xiàn)有45S rDNA信號(hào)丟失的現(xiàn)象(Lietal.， 2021)。顯然，F(xiàn)ISH技術(shù)已成為追蹤植物減數(shù)分裂過程中特定染色體行為的可靠手段。

‘銀中楊’(Populusalba×P.berolinensis‘Yinzhong’, 2n = 3x = 57)是以銀白楊(P.alba)為母本，中東楊(P.berolinensis)為父本，人工雜交選育的優(yōu)良三倍體雄性無性系(沈清越等， 1985； 陳成彬， 2004)，因其生長迅速、抗逆性強(qiáng)而廣泛栽種于我國東北、西北和華北等地區(qū)(范竹珊等， 2000)。Wang等(2017a)利用常規(guī)壓片法對(duì)‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程的染色體行為進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)染色體提前分離、落后染色體、微核和紡錘體定向紊亂等大量染色體異常行為，然而對(duì)于特定染色體在減數(shù)分裂過程中的行為仍不明確。因此，本研究以‘銀中楊’為材料，在篩選其小孢子母細(xì)胞最適酶解制片條件的基礎(chǔ)上，通過45S rDNA探針的FISH定位，對(duì)45S rDNA探針信號(hào)在減數(shù)分裂過程的分布進(jìn)行了詳細(xì)統(tǒng)計(jì)與分析，為楊樹異源三倍體減數(shù)分裂染色體配對(duì)和分離的行為追蹤提供了研究思路和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

‘銀中楊’花枝采集于內(nèi)蒙古通遼市，運(yùn)至北京林業(yè)大學(xué)溫室(10～20 ℃)水培。用卡諾固定液(V(乙醇)：V(乙酸)= 3∶1)分批固定花芽，浸于70%乙醇中，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 小孢子母細(xì)胞染色體制片 將小孢子母細(xì)胞處于減數(shù)分裂過程的花藥用鑷子取下，蒸餾水清洗3次，每次5 min，移至不同濃度纖維素酶(Cellulase R-10)與果膠酶(Pectolyase Y-23)混合酶液(表1)中，酶解2.5 h，常規(guī)醋酸洋紅染色壓片法制片觀察以篩選最適酶液組合。在此基礎(chǔ)上，再以最適酶液組合將花藥分別酶解1.5、2、2.5、3、3.5 h，以篩選最佳酶解時(shí)間。以篩選的最適酶液組合和酶解時(shí)間進(jìn)行酶解處理，壓片法制片，經(jīng)冰凍揭蓋片后，-20 ℃保存?zhèn)溆靡宰髟浑s交分析。

1.2.2 原位雜交 將凍存的玻片置于100 μg·mL-1RNA酶中37 ℃處理1 h； 轉(zhuǎn)入5 μg·mL-1胃蛋白酶溶液中37 ℃處理40 min； 2×SSC洗脫3次，每次3 min，移至4%多聚甲醛中室溫處理10 min； 2×SSC洗脫3次，每次3 min； 70%、90%、100%乙醇梯度脫水各3 min，氣干。

含有45S rDNA基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichiacoli)來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院王桂香老師饋贈(zèng)，通過地高辛缺口平移試劑盒(Roche, No. 11745816910)標(biāo)記。

FISH方法參考Cao等(2019)并略作修改。探針雜交液包含50%去離子甲酰胺(Deionized Formamide, FAD)、10%硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate, DS)、2×SSC、0.25%十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)和0.5 ng·μL-1的DNA探針。經(jīng)20 μg·mL-1Anti-digoxigenin-fluorescein(Roche, No. 11207741910)處理后，用DAPI(4′, 6- diamidino- 2- phenylindole)復(fù)染。在Olympuc BX53熒光顯微鏡下觀察，并用蔡司Meta Systems Isis熒光成像分析系統(tǒng)拍照。每個(gè)時(shí)期統(tǒng)計(jì)50個(gè)細(xì)胞以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘銀中楊’花粉母細(xì)胞染色體制片技術(shù)優(yōu)化

將‘銀中楊’花藥置于16種不同配方的酶液中酶解2.5 h后，制備細(xì)胞懸液，采用常規(guī)壓片法進(jìn)行制片觀察，比較細(xì)胞解離情況(表1)。其中，第1至6號(hào)處理制片中存在大塊未被酶解的花藥組織，與部分小孢子母細(xì)胞雜糅交疊，難以獲得游離的小孢子母細(xì)胞。第7和8號(hào)處理制片中存在部分未被徹底酶解的花藥細(xì)胞團(tuán)，小孢子母細(xì)胞解離情況一般，細(xì)胞質(zhì)較厚，染色體分散程度差(圖1a—g)。第10至12號(hào)處理制片中存在少部分花藥細(xì)胞團(tuán)，小孢子母細(xì)胞交疊情況偶有發(fā)生，細(xì)胞質(zhì)較薄，染色體分散程度一般。第14號(hào)處理的酶解效果較好，制片中小孢子母細(xì)胞解離良好且細(xì)胞質(zhì)較薄，染色體較清晰。盡管第15和16號(hào)處理制片中細(xì)胞解離程度良好，但小孢子母細(xì)胞酶解過度，從而細(xì)胞破裂，導(dǎo)致染色體不完整(圖1h)。

為獲得更好的制片效果，利用第14號(hào)酶液組合對(duì)酶解時(shí)間進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，酶解1.5 h制片中有較多大塊花藥組織，大部分花粉母細(xì)胞存在重疊現(xiàn)象，游離的花粉母細(xì)胞較少。酶解3 h時(shí)制片效果最佳，細(xì)胞解離程度良好，細(xì)胞質(zhì)薄，背景干凈，染色體形態(tài)清晰而分散(圖1i—p)。酶解3.5 h時(shí)花粉母細(xì)胞破裂，染色體丟失。

表1 不同酶液配方對(duì)‘銀中楊’花藥的酶解效果①Tab.1 Enzymatic hydrolysis effects of different cellulase and pectinase concentrations on the anthers of Populus alba × P. berolinensis ‘Yinzhong’

圖1 不同酶解處理的‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體制片比較Fig.1 Meiotic chromosome preparation of Populus alba × P. berolinensis ‘Yinzhong’ pollen mother cells (PMCs) treated with different enzymesa—g: 37 ℃下在1% 纖維素酶+2% 果膠酶混合酶液中處理2.5 h后的小孢子母細(xì)胞； h: 酶解過度而破裂的小孢子母細(xì)胞； i—p: 37 ℃下在3% 纖維素酶+1% 果膠酶混合酶液中處理3 h后的小孢子母細(xì)胞。標(biāo)尺等于10 μm。a-g: Pollen mother cell were digested with 1% cellulase +2% pectinase at 37 ℃ for 2.5 h; h: Pollen mother cell ruptured by excessive enzymolysis; i-p: Pollen mother cells were digested with 3% cellulase+1% pectinase at 37 ℃ for 3 h. Bars are equal to 10 μm.

因此，‘銀中楊’花藥在37 ℃下以3%纖維素酶+1%果膠酶混合液酶解3 h可獲得良好的制片效果，適于進(jìn)行FISH分析。

2.2 45S rDNA探針信號(hào)在減數(shù)第一次分裂過程的分離規(guī)律

通過FISH技術(shù)對(duì)‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期染色體上的45S rDNA探針信號(hào)進(jìn)行了定位和統(tǒng)計(jì)(表2)。在粗線期細(xì)胞中探針信號(hào)清晰可見(圖2a)。在中期I細(xì)胞中，可觀察到3個(gè)45S rDNA探針信號(hào)分布于3條同源染色體上?；?53個(gè)中期I分裂相的信號(hào)定位統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)此3條同源染色體的配對(duì)主要呈現(xiàn)為三價(jià)體形式(圖2b)，約占69.28%； 此外，在28.10%的細(xì)胞中，表現(xiàn)為II+I的配對(duì)形式(圖2c)，在2.61%的細(xì)胞中表現(xiàn)為I+I+I的3個(gè)單價(jià)體存在的形式(圖2d)。

45S rDNA探針信號(hào)所在染色體在‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后期I呈現(xiàn)出復(fù)雜的不平衡分離模式，主要包括5種類型： 第一種為2/1分離類型，即兩個(gè)45S rDNA探針信號(hào)定位到紡錘體的一極，一個(gè)信號(hào)定位在另一極(圖2e)，表明有一極有2條同源染色體，另一極只有1條同源染色體，約占所觀察細(xì)胞的83.90%； 第二種為3/0分離類型，即3個(gè)探針信號(hào)定位在同一極(圖2g)，表明3條同源染色體在后期I未發(fā)生分離，約占3.39%； 第三種為2/0+1分離類型，即兩個(gè)45S rDNA探針信號(hào)定位到一極，另一個(gè)信號(hào)位于落后染色體上(圖2f)，表明兩條同源染色體移動(dòng)到了同一極，另一條同源染色體未能及時(shí)移動(dòng)而成為落后染色體，該類型約占3.39%； 第四種為1/1+1分離類型，即兩極各存在1個(gè)探針信號(hào)，另一個(gè)信號(hào)位于落后染色體上，表明兩極各具有1條同源染色體，另一條同源染色體在分離時(shí)成為落后染色體，該類型約占5.93%； 第五種為1/0+2分離類型，即1個(gè)探針信號(hào)位于紡錘體一極，另一極無信號(hào)，有2個(gè)信號(hào)位于落后染色體上，表明只有1條同源染色體正常移動(dòng)到一極，其余2條同源染色體均成為落后染色體，該類型約占3.39%。45S rDNA探針信號(hào)在末期I的2個(gè)子核中呈現(xiàn)松散彌散狀態(tài)(圖2 h； 圖2i)，信號(hào)在子核中數(shù)目除了正常的2/1型分離(約占93.44%)外，還存在1/1(圖2i)、2/0、1/0等分離類型，分別占3.28%、1.64%和1.64%。

表2 ‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期的45S rDNA探針信號(hào)分布統(tǒng)計(jì)①Tab.2 Distribution of 45S rDNA signals in different stages of meiosis in pollen mother cells (PMCs) of Populus alba × P. berolinensis ‘Yinzhong’

圖2 45S rDNA信號(hào)在‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)第一次分裂各時(shí)期的分布Fig. 2 Distribution of 45S rDNA signals in different stages of meiosis I in pollen mother cells (PMCs) of Populus alba × P. berolinensis ‘Yinzhong’a： 粗線期； b—d: 中期I； b： 信號(hào)在三價(jià)體上； c： 信號(hào)定位于1個(gè)單價(jià)體和1個(gè)二價(jià)體上； d： 信號(hào)定位于3個(gè)單價(jià)體； e—g： 后期I； e： 2個(gè)信號(hào)定位在一極，1個(gè)定位在另一極； f： 2個(gè)信號(hào)在一極，另一個(gè)信號(hào)定位于落后染色體上； g： 3個(gè)信號(hào)定位在同一極，另一極無信號(hào)； h—i： 末期I； h： 一個(gè)子核中具有2個(gè)信號(hào)，另一個(gè)子核中具有1個(gè)信號(hào)； i： 2個(gè)子核中各具有1個(gè)信號(hào)。綠色為45S rDNA信號(hào)。白色箭頭所指為信號(hào)所定位的落后染色體。標(biāo)尺等于10 μm。a: Pachytene; b-d： Metaphase I; b: Signals localized on a trivalent; c: Signals localized on 1 univalent and 1 bivalent; d: Signals localized on 3 univalents; e-g: Anaphase I; e: 2 signals localized on one pole and 1 on the other; f: 2 signals on one pole and the other on a lagging chromosome; g: 3 signals are localized on the same pole and the other is no signal; h-i: Telophase I; h: 2 signals on 1 daughter nucleus and 1 signal on the other; i: 1 signal in each of the two daughter nuclei. 45S rDNA signal in green. The white arrow indicates the lagging chromosome where the signal is located. Bars are equal to 10 μm.

圖3 45S rDNA信號(hào)在‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)第二次分裂各時(shí)期的分布Fig. 3 Distribution of 45S rDNA signals in different stages of meiosis II in pollen mother cells (PMCs) of Populus alba × P. berolinensis ‘Yinzhong’a—c： 中期II； a： 2個(gè)信號(hào)位于一組染色體上，1個(gè)信號(hào)位于另一組染色體上； b： 2組染色體上各具有1個(gè)信號(hào)，另一個(gè)信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)中的微核染色體上； c： 2個(gè)信號(hào)位于一組染色體上，1個(gè)信號(hào)位于另一組染色體上，具有三極紡錘體的中期II細(xì)胞； d—f： 后期II； d： 4個(gè)紡錘體極分別有2個(gè)信號(hào)、2個(gè)信號(hào)、1個(gè)信號(hào)和1個(gè)信號(hào)； e： 2個(gè)信號(hào)定位于紡錘體一極，其余3個(gè)紡錘體極各具有1個(gè)信號(hào)，1個(gè)信號(hào)位于落后染色體上； f： 每一極各有1個(gè)信號(hào)； g—l： 末期II； g： 每個(gè)子核中分別有2個(gè)、2個(gè)、1個(gè)和1個(gè)信號(hào)； h： 每個(gè)子核中分別有2個(gè)、1個(gè)、1個(gè)和1個(gè)信號(hào)； i： 每個(gè)子核中分別有1個(gè)信號(hào)； j： 每個(gè)子核中分別有2個(gè)、1個(gè)、1個(gè)和1個(gè)信號(hào)，另一個(gè)信號(hào)位于微核上； k： 兩個(gè)子核中各有3個(gè)信號(hào)； l： 3個(gè)子核中分別有3個(gè)、2個(gè)和1個(gè)信號(hào)。綠色為45S rDNA信號(hào)。白色箭頭所指為信號(hào)所定位的落后染色體或微核。標(biāo)尺等于10 μm。a-c: Metaphase II; a: 2 signals on one set of chromosomes and 1 on another; b: Each of the 2 sets of chromosomes has 1 signal, and the other signal is located on the micronucleus chromosome in the cytoplasm; c: 2 signals on 1 set of chromosomes, 1 signal on another set of chromosomes, metaphase II cells with tripolar spindle; d-f: Anaphase II; d: 4 spindles have 2 signals, 2 signals, 1 signal and 1 signal respectively; e: 2 signals are located at one pole of the spindle, the other three spindle poles each have 1 signal, and 1 signal is located on the backward chromosome; f: Each pole has 1 signal; g-l: Telophase II; g: There are 2, 2, 1 and 1 signals in each daughter nucleus; h: There are 2, 1, 1 and 1 signals in each daughter nucleus; i: There is 1 signal in each daughter nucleus; j: There are 2, 1, 1 and 1 signals in each subnuclei, and the other signal is located on the micronucleus; k: 3 signals in each of the two daughter nuclei; l: 3, 2 and 1 signals in each of the three daughter nuclei. Green is the 45S rDNA signal. The white arrow indicates the lagging chromosome or micronucleus where the signal is located. Bars are equal to 10 μm.

2.3 45S rDNA探針信號(hào)在減數(shù)第二次分裂過程的分離規(guī)律

45S rDNA探針信號(hào)在小孢子母細(xì)胞減數(shù)第二次分裂中的分離較減數(shù)第一次分裂更加復(fù)雜。對(duì)107個(gè)中期II細(xì)胞的45S rDNA探針信號(hào)數(shù)量和分離情況進(jìn)行觀察，可分為9種同源染色體分離類型(表2)： 約有80.37%的細(xì)胞呈現(xiàn)為2/1分離類型，即2個(gè)探針信號(hào)位于中期II細(xì)胞的一組染色體上，1個(gè)探針信號(hào)位于另一組染色體上(圖3a)； 約1.87%的細(xì)胞呈現(xiàn)3/0分離類型，即3個(gè)探針信號(hào)在同一組染色體上，另一組染色體上未顯示信號(hào)； 約3.74%的細(xì)胞呈現(xiàn)1/1+1分離類型，即2組染色體上各有1個(gè)探針信號(hào)，另一個(gè)探針信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)中的微核染色體上(圖3b)； 約2.80%的細(xì)胞呈現(xiàn)2/0+1分離類型，即2個(gè)探針信號(hào)在同一組染色體上，另一個(gè)探針信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)中的微核染色體上； 此外，還存在1/1、2/0、1/0、0/0+2、1/0+1等分離類型，分別占3.47%、2.80%、2.80%、0.93%和0.93%。

隨后期II姊妹染色單體的分離，位于姊妹染色單體上的2個(gè)45S rDNA探針信號(hào)也隨之分離，大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)出2/2/1/1的分離類型(圖3d)，即4個(gè)紡錘體極分別包含2個(gè)、2個(gè)、1個(gè)和1個(gè)信號(hào)，占后期II觀察細(xì)胞總數(shù)的約73.08%。同時(shí)，還存在部分3/1/1/1分離類型的細(xì)胞，推測(cè)可能有一對(duì)姊妹染色單體未正常分離，約占5.77%； 2/2/1/0+1和2/1/1/1+1(圖3e)等1個(gè)信號(hào)定位于落后染色體上的分離類型各占5.77%，推測(cè)姊妹染色單體中的1條存在分離滯后的現(xiàn)象。此外，約有9.61%的后期II細(xì)胞中僅可觀察到2～4個(gè)45S rDNA探針信號(hào)(圖3f)。

在末期II細(xì)胞中，隨染色體的逐漸解螺旋，45S rDNA探針信號(hào)也逐漸松散。通過對(duì)100個(gè)末期II細(xì)胞的觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，約63%的細(xì)胞中探針信號(hào)呈2/2/1/1分離類型(圖3g)，即在正常末期II細(xì)胞的4個(gè)分散的子核中分別包含1～2個(gè)探針信號(hào)。同時(shí)，也統(tǒng)計(jì)到一些特殊的染色體分離類型，其中2/2/2/0和3/2/1/0的分離類型各占約1%和2%； 在約5%的末期II細(xì)胞中，觀察到部分45S rDNA探針信號(hào)定位于微核上(圖3j)，推測(cè)其可能由包含探針信號(hào)的落后染色體發(fā)育而來。此外，在約18%的末期II細(xì)胞中，僅觀察到2～5個(gè)探針信號(hào)(圖3h—i)。

‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂末期II存在核融合的情況，經(jīng)胞質(zhì)分裂可能形成二分體和三分體。其中，在具2個(gè)融合核的二分體細(xì)胞中，探針信號(hào)呈現(xiàn)出4/2、3/3(圖3k)、4/1和3/2+1的分離類型，分別占統(tǒng)計(jì)末期II細(xì)胞數(shù)的2%、3%、1%和1%。對(duì)于具1個(gè)融合核和2個(gè)非融合子核的細(xì)胞而言，探針信號(hào)的分離則包括了3/2/1(約占1%圖3 l)、2/2/2(約占1%)、4/1/1(約占1%)和3/1/1(約占1%)等類型。顯然，‘銀中楊’減數(shù)分裂過程這些復(fù)雜的子核染色體分離將導(dǎo)致其配子染色體組成的豐富變異。

3 討論

小孢子母細(xì)胞位于花粉囊內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)濃厚，被胼胝質(zhì)層所包裹，常規(guī)壓片法獲得的減數(shù)分裂染色體制片背景較深(辛昊陽等， 2016)，因此開展減數(shù)分裂染色體FISH研究時(shí)，通常需要通過酶解途徑釋放細(xì)胞，以獲得分散良好的染色體制片(Wangetal., 2017b； Xinetal., 2018； Azumietal., 2001)。Li等(2018)進(jìn)行黃瓜減數(shù)分裂FISH研究時(shí)使用了4%纖維素酶+2%果膠酶混合液進(jìn)行花藥酶解，獲得良好染色體制片。適用于犬薔薇(RosaSect.Caninae)減數(shù)分裂染色體制片的條件是將花藥置于1%纖維素酶+0.2%果膠酶+0.5%半纖維素酶中酶解2 h(Lunerovetal., 2020)?？梢姡煌参锘ㄋ幟附馓幚淼倪m宜酶解條件有所差異。本研究篩選出適用于三倍體‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體制片的酶解條件為37 ℃下將花藥置于3%纖維素酶+1%果膠酶混合液中酶解3 h，獲得的制片染色體完整而分散，細(xì)胞質(zhì)薄，有利于后續(xù)FISH分析時(shí)探針的滲入，從而降低了細(xì)胞質(zhì)對(duì)雜交信號(hào)的遮擋，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于45S rDNA序列高度重復(fù)而保守，使其作為分子探針具有較高檢出率和信號(hào)強(qiáng)度，易于追蹤減數(shù)分裂期間染色體行為(趙洋， 2020； 王璐等， 2020)。本研究以45S rDNA作為探針對(duì)‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期的染色體行為進(jìn)行跟蹤分析，均產(chǎn)生了清晰明亮的熒光信號(hào)，充分證明了其適用性和有效性。Xin等(2020)利用FISH技術(shù)將45S rDNA探針定位在了大葉楊(P.lasiocarpa)、美洲黑楊(P.deltoides)和毛果楊(P.trichocarpa)8號(hào)與14號(hào)染色體，毛白楊(P.tomentosa)14號(hào)染色體以及胡楊(P.euphratica)的9號(hào)染色體上，為楊屬植物染色體識(shí)別提供了重要信息。‘銀中楊’作為白楊派和黑楊派樹種的遠(yuǎn)緣雜種，中期I細(xì)胞中45S rDNA探針信號(hào)僅定位于3條染色體上，但具體位于第幾號(hào)染色體還不能做出判斷，未來可結(jié)合基因組測(cè)序信息進(jìn)一步設(shè)計(jì)特定染色體探針，通過體細(xì)胞FISH研究加以鑒定。

多倍體減數(shù)分裂過程中染色體配對(duì)方式體現(xiàn)染色體之間的異質(zhì)性，在一定程度上反映了親本間的親緣關(guān)系(Luetal., 1997)。在兩親本物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的異源四倍體黃瓜中，同源染色體主要以二價(jià)體形式配對(duì)，單價(jià)體、三價(jià)體和四價(jià)體配對(duì)的情況少有發(fā)生(Wangetal., 2017b)。He等(2018)研究表明，同源四倍體馬鈴薯(Solanumtuberosum)減數(shù)分裂過程中有78.4%的7號(hào)染色體以四價(jià)體形式配對(duì)，僅1%的細(xì)胞中存在單價(jià)體和三價(jià)體。Wang等(2017a)通過常規(guī)醋酸洋紅染色壓片法分析了‘銀中楊’減數(shù)分裂平均配對(duì)構(gòu)型，為15.2I+14.0II+4.6III，可見其三價(jià)體的配對(duì)形式較少，基因組間雜合性較高。本研究利用45S rDNA為探針的FISH分析發(fā)現(xiàn)信號(hào)所在染色體在中期I存在III、II+I、I+I+I 3種形式，其中三價(jià)體(圖2b)發(fā)生頻率為69.28%，明顯高于其他配對(duì)形式，表明雖然‘銀中楊’基因組間雜合性較高，但45S rDNA探針信號(hào)所定位的染色體親緣關(guān)系可能較近。

受雜交和多倍化的影響，‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后期I、后期II、末期II中染色體滯后和微核的現(xiàn)象高頻發(fā)生(Wangetal., 2017a)。本研究發(fā)現(xiàn)45S rDNA探針信號(hào)同樣可能定位到后期I、中期II、后期II、末期II細(xì)胞的1～2個(gè)落后染色體或微核上，但后期II細(xì)胞中具有落后染色體的比率(約11.54%)大于末期II形成微核的細(xì)胞比率(約6%)，這表明并非所有落后染色體均形成微核。在末期II的部分細(xì)胞中，無論定位于子核還是微核，所觀察到的探針信號(hào)總數(shù)未達(dá)到理論上的6個(gè)，推測(cè)減數(shù)分裂過程可能發(fā)生落后染色體或微核的降解或丟失。

三倍體物種盡管高度敗育，但也可能產(chǎn)生少量具有功能的n= x配子、n= 2x配子甚至非整倍性配子，通過雜交獲得不同倍性水平的新種質(zhì)(Kohleretal., 2010； Kingetal., 1998； Zhangetal., 2009)。Wang等(2017a)發(fā)現(xiàn)‘銀中楊’花粉育性僅為2.78%，并與二倍體毛新楊(P.tomentosa×P.bolleana‘TB03’)進(jìn)行雜交獲得了二倍體、三倍體、四倍體以及非整倍體后代。本研究在‘銀中楊’末期II細(xì)胞的融合核中觀察到3～4個(gè)45S rDNA探針信號(hào)，推測(cè)其形成的配子中將包含3～4條45S rDNA探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的染色體，若這些配子具有活力，則雜交后可能形成包含4～5條該染色體的子代，從而為開展染色體工程育種提供豐富的種質(zhì)材料。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)三倍體‘銀中楊’花藥最適酶解條件的探究，摸索出適用于其小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂FISH研究染色體制片的酶解條件為用3%纖維素酶+1%果膠酶混合液在37 ℃下酶解3 h，表明僅通過優(yōu)化酶解條件即可充分釋放小孢子母細(xì)胞，獲得高質(zhì)量減數(shù)分裂染色體制片。進(jìn)一步利用45S rDNA探針開展FISH研究結(jié)果表明三倍體‘銀中楊’小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程染色體行為復(fù)雜。45S rDNA探針信號(hào)定位于3條同源染色體上，在中期I呈現(xiàn)的三種配對(duì)形式中III發(fā)生頻率最高，表明信號(hào)所定位的染色體親緣關(guān)系可能較近。大多數(shù)探針信號(hào)在后期I至中期II為2/1分離，在后期II至末期II呈現(xiàn)2/2/1/1的分離模式，表明探針信號(hào)所定位的染色體在大部分細(xì)胞中遵循正常的分離規(guī)律，但部分細(xì)胞中探針信號(hào)所對(duì)應(yīng)的1～2條染色體在后期I、中期II、后期II、末期II發(fā)生分離滯后或形成微核，進(jìn)而可能在后續(xù)發(fā)育過程中丟失。末期II細(xì)胞中存在3～4個(gè)45S rDNA探針信號(hào)的融合核可能形成具有2 n甚至超數(shù)染色體的配子。相關(guān)研究結(jié)果表明，利用FISH技術(shù)可對(duì)楊樹減數(shù)分裂過程的特定染色體行為進(jìn)行定位和精準(zhǔn)分析，顯著推動(dòng)林木細(xì)胞遺傳學(xué)研究進(jìn)展。