哈密淖毛湖主栽甜瓜病原微生物分離及鑒定

王志慧，霍向東，李江峰，翟 勇，李佩琪，秦新政

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；2. 哈密市農(nóng)業(yè)農(nóng)機技術(shù)推廣服務(wù)中心，新疆哈密 839001；3. 哈密隆泰農(nóng)業(yè)科技有限公司，新疆哈密 848400；4.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊，830046)

0 引 言

【研究意義】新疆哈密地區(qū)年均日照時數(shù)長達3 358 h，是全國日照時數(shù)最多的地區(qū)之一，適于甜瓜(CucumismeloL.)的栽培。其中哈密淖毛湖地區(qū)作為甜瓜傳統(tǒng)種植區(qū)，一直以其作為當?shù)刂匾慕?jīng)濟作物[1-3]，該地區(qū)早、中熟甜瓜產(chǎn)區(qū)面積1 733 hm2(2.6萬畝)，中、晚熟甜瓜產(chǎn)區(qū)面積3 333 hm2(5萬畝)[4]，存在連作現(xiàn)象，甜瓜病害發(fā)生嚴重[5]。【前人研究進展】長期連作可能會造成甜瓜土傳病害發(fā)生嚴重，隨種植年限延長主要病原真菌核盤菌屬(Sclerotinia)、輪枝孢屬(Verticillium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌(Fusarium)等菌種數(shù)量增加[5]；甜瓜主要病害包括甜瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、甜瓜炭疽病、甜瓜白粉病、甜瓜霜霉病、甜瓜細菌性果斑病及甜瓜疫病等[6]。甜瓜枯萎病在整個生長周期均可發(fā)病，嚴重時發(fā)病率達30%～50%，影響甜瓜產(chǎn)量和質(zhì)量[7]；甜瓜蔓枯病主要危害甜瓜的莖、葉、瓜及卷須等[8]；甜瓜炭疽病主要危害果實，嚴重時發(fā)病率超過50%[9]；甜瓜白粉病主要危害莖和果實的生長發(fā)育，降低甜瓜果實品質(zhì)和產(chǎn)量等[10]?！颈狙芯壳腥朦c】膨大期是甜瓜病害集中爆發(fā)期，而目前甜瓜防治措施主要是在出現(xiàn)病癥前期或中期根據(jù)病害類型化學(xué)防治，忽略了病原微生物潛伏期的防治，對膨大期發(fā)生的病害防治手段有限，有必要對該時期健康株及病株病原微生物進行深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選擇哈密淖毛湖地區(qū)主栽甜瓜品種黃86及西州蜜17號，在其膨大期健康、發(fā)病植株的病原微生物進行分離和鑒定，對比健康株及病株樣品中的微生物，研究潛在的病原菌及微生物病害種類，為哈密淖毛湖地區(qū)主栽品種的甜瓜病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 甜瓜品種

采集哈密地區(qū)主栽甜瓜品種西州蜜17號和黃86的膨大期健康及發(fā)病甜瓜的根、根際土、藤蔓及果實。西州蜜17號和黃86樣品分別于2021年7月19～29日采自淖毛湖開發(fā)區(qū)路東四條田(43°46′N，94°55′E，海拔383 m)，共計采集樣品13份。

選擇典型發(fā)病植株將根挖出，敲掉根須上的土塊；去除表層雜物，采集根際0～30 cm以內(nèi)深度土樣；剪取具有明顯病斑的藤蔓；切下果實明顯發(fā)病部位，分別放入樣品袋中并立即于4℃保存。健康樣品按同樣方法取樣。

1.1.2 試劑及儀器

供試試劑為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(含氯霉素)，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉，天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Tris、 Agarose，美國GENVIEW公司；冰乙酸，西安化學(xué)試劑廠；乙二胺四乙酸二鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

供試儀器為SW-CJ-2D型超凈工作臺，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；H1650-W臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；AUW120型電子天平，日本島津。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 組織樣品

將各組織樣品剪裁成小塊后用去離子水將表面的雜質(zhì)沖洗干凈，并在濾紙上晾干；將晾干的組織塊在超凈臺中用75%酒精浸泡1 min，超純水沖洗后于無菌水中漂洗，控干組織表面無菌水；將組織塊置于無菌研缽中，研磨至組織松散后轉(zhuǎn)移至無菌50 mL離心管中，加入20 mL無菌水，搖勻并標記，存放于4℃。

1.2.1.2 土壤樣品

將土壤中石塊、根須等雜質(zhì)去除后稱取0.4 g土樣，放入裝有40 mL 0.8%無菌生理鹽水的100 mL三角瓶中(含3顆無菌玻璃珠)，在25℃、180 r/min搖床上振搖30 min。

1.2.2 病原微生物分離、純化培養(yǎng)

吸取1 mL的樣品溶液加入于9 mL無菌生理鹽水試管中，搖勻，逐級稀釋并分別涂布于PDA及LB平板上，于25及37℃黑暗培養(yǎng)。待分離物長出后，挑取菌落形態(tài)不一樣的單菌落，在PDA及LB平板上采用劃線法分離培養(yǎng)微生物，將純化菌株在4℃下保存于PDA及LB斜面。

1.2.3 DNA提取與基因序列擴增

將PDA培養(yǎng)平板上的菌絲刮下于液氮研磨，使用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌絲DNA，細菌采用細菌基因組DNA抽提試劑盒進行DNA提取。真菌選用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，細菌則選用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTG-3')進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，2×MasterMix 12.5 μL，加 dd H2O 補足至 25 μL。細菌反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min；真菌反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共34個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測得的基因序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行 BLAST序列比對，確定微生物分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜黃86膨大期菌種分離及鑒定

研究表明，可培養(yǎng)菌株8株，其中細菌4株，真菌4株。從根部分離細菌2株，假單胞菌屬(Pseudomonasvranovensis)及不動桿菌屬(Acinetobactercalcoaceticus)各1株；真菌2株，織球殼屬(Plectosphaerellacucumerina)及毛束霉屬(Trichurusspiralis)各1株。從藤蔓分離細菌2株，假單胞菌屬(Pseudomonashibiscicola)及腸桿菌屬(Enterobactercloacae)各1株；真菌2株，Vishniacozyma屬(Vishniacozymavictoriae)及根菌屬(Talaromycesradicus)各1株。

得到可培養(yǎng)菌株15株，細菌9株，真菌6株。從根部分離細菌4株，不動桿菌屬(Acinetobactercalcoaceticus)、假單胞菌屬(Pseudomonasbrassicacearum)、泛菌屬(Pantoeaagglomerans)及Peribacillus屬(Peribacillussimplex)各1株；真菌4株，分別為輪枝菌屬(Verticilliumdahliae)、刺盤孢菌屬(Colletotrichumpisi)、球二孢屬(Lasiodiplodiatheobromae)及鐮刀菌屬(Fusariumoxysporum)各1株。從藤蔓分離細菌6株，假單胞菌屬(Pseudomonasbaetica、Pseudomonasfluorescens)、芽孢桿菌屬(Bacillusaltitudinis、Bacillussubtilis)各2株，泛菌屬(Pantoeaagglomerans)及類芽孢桿菌屬(Paenibacillustundrae)各1株；真菌2株，毛束霉屬(Trichurusspiralis)及Vishniacozyma屬(Vishniacozymatephrensis)各1株。表1

表1 甜瓜黃86膨大期樣品菌種分離、鑒定Table 1 Strain isolation and identification of muskmelon Yellow no. 86 samples during expansion stage

2.2 甜瓜西州蜜17號膨大期菌種分離及初步鑒定

研究表明，得到可培養(yǎng)菌株24株，細菌17株，真菌7株。從根分離部細菌5株，其中腸桿菌屬2株(Enterobactercancerogenus、Enterobactersoli)，拉烏爾菌屬(Raoultellaterrigena)、假單胞菌屬1株(Pseudomonasfluorescens)及泛菌屬(Pantoeaagglomerans)各1株；真菌2株，各枝孢屬(Cladosporiumsinuosum、Cladosporiumherbarum)。從藤蔓分離細菌5株，其中芽孢桿菌屬2株(Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquefaciens)，腸桿菌屬(Enterobactercloacae)、假單胞菌屬1株(Pseudomonashibiscicola)及微小桿菌屬(Exiguobacteriumundae)各1株。從果實分離細菌3株，其中腸桿菌屬2株(Enterobacterhormaechei、Enterobactersoli)，芽孢桿菌屬1株(Bacillusamyloliquefaciens)。從土樣分離細菌7株，其中芽孢桿菌屬3株(Bacilluscereus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluszhangzhouensis)，Mesobacillus屬(Mesobacillussubterraneus)、假單胞菌屬(Pseudomonasalcaligenes)、微小桿菌屬(Exiguobacteriumacetylicum)及Peribacillus屬(Peribacillusbutanolivorans)各1株；真菌5株，其中鐮刀菌屬2株(Fusariumfalciforme、Fusariumchlamydosporum)，曲霉屬(Aspergillusnidulans)、鏈格孢屬(Alternariaalternata)及環(huán)帶狀枝頂孢(Acremoniumsclerotigenum)各1株。

得到可培養(yǎng)菌株27株，細菌20株，真菌7株。從根部分離細菌3株，腸桿菌屬(Enterobacterludwigii)、假單胞菌屬(Pseudomonasputida)、亞特蘭大桿菌屬(Atlantibacterhermannii)各1株；真菌2株，各鐮刀菌屬(Fusariumsolani、Fusariumhaematococcum)。從藤蔓分離細菌3株，其中腸桿菌屬(Enterobactercloacae)、腸球菌屬(Enterococcuscasseliflavus)及克雷伯氏菌屬(Klebsiellaoxytoca)各1株；真菌1株，為枝孢屬(Cladosporiumcladosporioides)。從果實分離細菌3株，其中腸桿菌屬(Enterobacterhormaechei)、芽孢桿菌屬(Bacillussiamensis)及乳球菌屬(Lactococcuslactis)各1株。從土樣分離細菌11株，其中芽孢桿菌屬4株(Bacillussubtilis、Bacillusvelezensis、Bacillusatrophaeus、Bacilluspumilus)，Priestia屬2株(Priestiamegaterium、Priestiaaryabhatta)，假單胞菌屬(Pseudomonasmendocina)、短桿菌屬(Brevibacteriumfrigoritolerans)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobiummeliloti)、Rossellomorea屬(Rossellomoreavietnamensis)及假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonaskoreensis)各1株；真菌4株，其中曲霉屬2株(Aspergillusniger、Aspergillussydowii)，枝孢屬(Cladosporiumfusiform)及環(huán)帶狀枝頂孢(Acremoniumzonatum)各1株。圖1

注：a：甜瓜西州蜜17號根部樣品可培養(yǎng)菌株分離鑒定圖；b：甜瓜西州蜜17號蔓部樣品可培養(yǎng)菌株分離鑒定圖；c：甜瓜西州蜜17號果實樣品可培養(yǎng)菌株分離鑒定圖；d：甜瓜西州蜜17號根際土樣品可培養(yǎng)菌株分離鑒定圖

2.3 甜瓜黃86膨大期潛在病原微生物

研究表明，潛在病原微生物共計約4株，其中細菌1株，真菌3株。成團泛菌(Pantoeaagglomerans)為細菌性病害，可侵染多種植物，如玉米、楊樹、核桃、棉花、火龍果、核桃等的腐爛病、黑斑病等。表2

表2 甜瓜黃86膨大期甜瓜樣品病原菌及相關(guān)關(guān)聯(lián)病害Table 2 Correlation list of pathogenic bacteria and related diseases of muskmelon huang 86 at expanding stage

2.4 甜瓜西州蜜17號膨大期潛在病原微生物

研究表明，潛在病原微生物共計約4株，其中細菌1株，真菌3株。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)可引起鷹嘴桃腐爛病，表3

表3 甜瓜西州蜜17號膨大期甜瓜樣品病原菌及相關(guān)關(guān)聯(lián)病害Table 3 Association list of pathogenic bacteria and related diseases of melon samples during the expansion period of Melon Honey west

3 討 論

冷害會加速哈密瓜果肉硬度下降，這與劉同業(yè)等[3]研究結(jié)果一致，佘小漫等[11]采用常規(guī)病組織分離法獲得2株可培養(yǎng)菌株鑒定為成團泛菌，經(jīng)致病性測定該細菌可引起冬棗葉片產(chǎn)生枯死癥狀；尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)可引起甜瓜枯萎病，黃文楓等[12]從患病薄皮甜瓜莖組織分離的尖孢鐮刀菌經(jīng)過凱氏驗證該病原菌為引起甜瓜枯萎病的致病菌；可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)為真菌性病原菌，可侵染多種作物，主要造成植株梢枯、枝枯、根腐、果腐、葉斑、潰瘍、流膠、變色、壞死等，石金巧等[13]以獼猴桃葉斑病典型癥狀葉片為試材確定引起獼猴桃葉斑病致病病原為可可毛色二孢菌；大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)可引起甜瓜黃萎病，何蘇琴等[14]通過對發(fā)病甜瓜采用組織分離法確定致病菌為大麗輪枝菌。

陳少先等[15]通過對采后鷹嘴桃病果病原菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)菌株貝萊斯芽孢桿菌ZK1的致病能力最強，是桃類果實的病原菌；枝狀枝孢霉菌(Cladosporiumcladosporioides)可引起香蕉煤污病，楊迪等[16]通過對廣西香蕉上新發(fā)生煤污病的病原及其生物學(xué)特性研究，發(fā)現(xiàn)枝狀枝孢霉為廣西香蕉煤污病的病原菌；腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)可引起甜瓜鐮孢根腐病，耿麗華等[17]通過對甜瓜設(shè)施栽培和露地栽培中甜瓜鐮孢根腐病的研究確定了病原菌為腐皮鐮孢菌；黑曲霉菌(Aspergillusniger)可引起鷹嘴桃腐爛病，陳少先等[15]通過對采后鷹嘴桃病果病原菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)黑曲霉亦為桃類果實的病原菌。

陳存坤[18]對甜瓜采后病害進行了分離鑒定，確認了甜瓜金鳳凰主要致病菌為鏈格孢菌屬、鐮孢屬及青霉屬；相似的研究方法還應(yīng)用在平菇[19]、核桃[20]和花椒[21]等作物的微生物病害研究中，發(fā)現(xiàn)了大量的病原菌和主要病害發(fā)生情況。

目前對哈密淖毛湖地區(qū)的甜瓜病原微生物的研究尚屬空白，研究通過采集哈密地區(qū)主栽甜瓜品種西州蜜17號和黃86(八六王)的膨大期健康及發(fā)病甜瓜的根、根際土、藤蔓及果實，共計13份，經(jīng)分離、培養(yǎng)及初步鑒定在甜瓜品種黃86健康株及病株中共計分離、培養(yǎng)鑒定可培養(yǎng)菌株23株，其中細菌13株，真菌10株，發(fā)現(xiàn)主要病原菌2株，為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)可分別引起甜瓜枯萎病、黃萎??；甜瓜品種西州蜜健康株及病株中共計分離、培養(yǎng)鑒定可培養(yǎng)菌株51株，其中細菌37株，真菌14株，發(fā)現(xiàn)主要病原菌1株，為腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)，可引起甜瓜鐮孢根腐病。

4 結(jié) 論

在甜瓜品種黃86健康株及病株中共計分離、培養(yǎng)鑒定可培養(yǎng)菌株23株，其中細菌13株，真菌10株，潛在病原菌4株，其中主要病原菌2株，為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)可分別引起甜瓜枯萎病、黃萎?。惶鸸掀贩N西州蜜健康株及病株中共計分離、培養(yǎng)鑒定可培養(yǎng)菌株51株，其中細菌37株，真菌14株，潛在病原菌4株，主要病原菌1株，為腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)，可引起甜瓜鐮孢根腐病。