外源低分子有機(jī)酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響

李芹梅，潘曲波，聞?dòng)阑?，夏小麗，彭麟迪，?瓊

(西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650224)

重金屬污染是全球性問(wèn)題，也是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。銅是植物必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，但過(guò)量時(shí)會(huì)有害，妨礙植物生長(zhǎng)和新陳代謝[1]。2014年發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)土壤重金屬總的點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，其中銅污染位居第4位，點(diǎn)位超標(biāo)率占2.1%[2]。因此，對(duì)銅污染土壤防治措施研究具有重要意義。

外源化學(xué)品處理是一種簡(jiǎn)單易行、見(jiàn)效快的降解植物重金屬毒性的方法[3]。蘋(píng)果酸和檸檬酸作為重要的低分子有機(jī)酸，參與植物生理代謝過(guò)程，對(duì)植物耐旱性、耐寒性、抗養(yǎng)分脅迫和抗重金屬脅迫能力等具有調(diào)節(jié)作用[4-5]。研究表明，添加適量有機(jī)酸對(duì)植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)有顯著影響，能增加植株生物量。莊正等[6]發(fā)現(xiàn)，低濃度蘋(píng)果酸和檸檬酸能促進(jìn)杉木種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)。低濃度檸檬酸浸種能提高番茄種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)[7]。15%檸檬酸浸種能提高苦蕎種子萌發(fā)率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)[8]。植物根系分泌的有機(jī)酸能提高其根系活力，促進(jìn)養(yǎng)分吸收和幼苗根系生長(zhǎng)[9-10]。詹淑威等[11]發(fā)現(xiàn)加入蘋(píng)果酸和檸檬酸能顯著提高小飛揚(yáng)草根系活力、減小根細(xì)胞膜透性。鎘脅迫下加入檸檬酸能使苧麻根系活力上升，緩解重金屬毒性[12]。鋁脅迫下植株根系會(huì)分泌檸檬酸和蘋(píng)果酸來(lái)抵御鋁毒害，緩解根際鋁毒[13-14]。

珊瑚櫻(SolanumpseudocapsicumL.)是茄科茄屬常綠小灌木，其果實(shí)為球形，觀(guān)賞期達(dá)3個(gè)月以上，是深受人們喜愛(ài)的觀(guān)果植物[15-16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，珊瑚櫻果實(shí)中含有大量低分子有機(jī)酸，主要成分為蘋(píng)果酸和檸檬酸。有機(jī)酸能與重金屬離子絡(luò)合，通過(guò)植物吸收、運(yùn)輸、積累等過(guò)程，降低重金屬毒性[5,17]。在重金屬脅迫下，不同濃度有機(jī)酸可能會(huì)影響珊瑚櫻生理代謝(如種子萌發(fā)、根系活力等)。因此，可考慮將珊瑚櫻作為修復(fù)重金屬土壤污染的植物材料。目前有關(guān)蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)重金屬脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響研究報(bào)道很少。鑒于此，本研究以珊瑚櫻種子為試驗(yàn)材料，研究不同濃度蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響，以充實(shí)有機(jī)酸緩解重金屬毒害作用的理論數(shù)據(jù)，為后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成熟珊瑚櫻果實(shí)采自西南林業(yè)大學(xué)一號(hào)門(mén)(E102°44′49″，N25°03′50″)旁邊。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 珊瑚櫻果實(shí)中有機(jī)酸成分提取 采集成熟珊瑚櫻果實(shí)19.02 g(鮮質(zhì)量)，搗碎后用200 mL甲醇浸泡48 h并過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20 mL后用石油醚等體積萃取3次，下層溶液真空濃縮后用色譜純甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后得到待測(cè)樣品。

1.2.2 銅質(zhì)量濃度篩選 挑選籽粒飽滿(mǎn)均勻的珊瑚櫻種子，在室溫下浸種6 h。設(shè)置7個(gè)質(zhì)量濃度的CuSO4處理，分別為0(CK)，10，20，40，60，80和100 mg/L。在培養(yǎng)皿底部鋪2層定性濾紙，每個(gè)處理放40粒種子，加入5 mL處理液，每個(gè)處理重復(fù)5次。將培養(yǎng)皿放置于(25±1) ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)催芽。種子萌發(fā)期間，每天上午10:00觀(guān)察、記錄種子發(fā)芽數(shù)，更換濾紙并施加處理液。

1.2.3 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子的處理 根據(jù)1.2.1和1.2.2試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在半致死狀態(tài)下，CuSO4溶液質(zhì)量濃度為40 mg/L，將此設(shè)置為銅脅迫水平。外源分別施加蘋(píng)果酸(MA)和檸檬酸(CA)對(duì)珊瑚櫻種子進(jìn)行處理，其濃度分別為1，3，5和10 mmol/L。試驗(yàn)共設(shè)置9個(gè)處理，分別為Cu40(pH 5.81)，Cu40+MA1(pH 3.31)，Cu40+MA3(pH 3.05)，Cu40+MA5(pH 2.83)，Cu40+MA10(pH 2.60)，Cu40+CA1(pH 3.20)，Cu40+CA3(pH 2.72)，Cu40+CA5(pH 2.62)和Cu40+CA10(pH 2.44)，其余處理方式同1.2.2。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 有機(jī)酸成分 采用HPLC-LTQ-Orbitrap(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)XL測(cè)定珊瑚櫻果實(shí)中的有機(jī)酸成分，通過(guò)Thermo xcalibur qual browser篩選軟件建立各化合物的分子式數(shù)據(jù)庫(kù)信息表，設(shè)立正離子模式下H+和Na+2種加合物離子，化合物篩選的離子提取窗口寬度為3×10-6。

1.3.2 種子萌發(fā)指標(biāo) 以胚根長(zhǎng)2 mm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每24 h統(tǒng)計(jì)1次發(fā)芽數(shù)，記錄第1粒種子發(fā)芽時(shí)間和種子萌發(fā)峰值時(shí)的時(shí)間，第4天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第8天終止珊瑚櫻種子萌發(fā)試驗(yàn)，從5個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取樣10株用游標(biāo)卡尺測(cè)量珊瑚櫻芽長(zhǎng)，精確到0.01 cm，參考郝俊峰等[18]的方法計(jì)算萌發(fā)指標(biāo)：

發(fā)芽率=(第8天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

發(fā)芽勢(shì)=(第4天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

發(fā)芽指數(shù)=∑(t天的發(fā)芽數(shù)/相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間)。

活力指數(shù)=芽長(zhǎng)×發(fā)芽指數(shù)。

平均發(fā)芽速率=∑(第t天的發(fā)芽數(shù)×相應(yīng)發(fā)芽粒數(shù))/總發(fā)芽粒數(shù)。

1.3.3 根系活力 采用TTC法[19]對(duì)珊瑚櫻根系活力進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件，對(duì)蘋(píng)果酸和檸檬酸處理銅脅迫下珊瑚櫻種子受抑的緩解作用進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和聚類(lèi)分析，繪圖用Origin 2021軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 珊瑚櫻果實(shí)中的有機(jī)酸成分

通過(guò)高分辨質(zhì)譜的精確相對(duì)分子量等結(jié)構(gòu)信息，確定珊瑚櫻果實(shí)含有的有機(jī)酸主要為蘋(píng)果酸和檸檬酸，其N(xiāo)a+加合物離子精確相對(duì)分子質(zhì)量、強(qiáng)度等見(jiàn)表1。

表1 成熟珊瑚櫻果實(shí)中的有機(jī)酸成分Table 1 Determination of organic acids in mature Solanum pseudocapsicum fruits

2.2 銅脅迫對(duì)珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，隨銅質(zhì)量濃度增加，珊瑚櫻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和芽長(zhǎng)均呈先增后降趨勢(shì)。在銅質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和芽長(zhǎng)都達(dá)到最大值，與CK均有顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)銅質(zhì)量濃度大于40 mg/L時(shí)，珊瑚櫻種子活力指數(shù)和芽長(zhǎng)顯著受抑(P<0.05)。與CK相比，40，60，80和100 mg/L CuSO4溶液處理珊瑚櫻種子活力指數(shù)分別降低52.28%，66.04%，75.57%和85.30%，芽長(zhǎng)分別縮短51.29%，64.22%，72.84%和82.33%。綜上可知，銅質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，珊瑚櫻種子發(fā)芽率顯著降低，且活力指數(shù)和芽長(zhǎng)的降幅均超過(guò)50%，因此確定珊瑚櫻種子銅脅迫質(zhì)量濃度為40 mg/L 。

表2 銅脅迫對(duì)珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of copper stress on seed germination of Solanum pseudocapsicum

2.3 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)特性的影響

2.3.1 對(duì)發(fā)芽時(shí)間和平均發(fā)芽速率的影響 從表3可知，銅脅迫下，用5 mmol/L蘋(píng)果酸(MA)處理后，第1粒珊瑚櫻種子發(fā)芽時(shí)間比Cu40處理種子提前了1 d，其平均發(fā)芽速率最快。當(dāng)蘋(píng)果酸濃度為10 mmol/L時(shí)，第1粒珊瑚櫻種子發(fā)芽時(shí)間、平均發(fā)芽速率均比Cu40處理種子時(shí)間長(zhǎng)。而用不同濃度檸檬酸(CA)處理的第1粒珊瑚櫻種子發(fā)芽時(shí)間、平均發(fā)芽速率均比Cu40處理種子慢。

表3 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子發(fā)芽時(shí)間及平均發(fā)芽速率的影響Table 3 Effects of malic acid and citric acid on germination time and average germination rate of Solanum pseudocapsicum seeds under copper stress

2.3.2 對(duì)種子萌發(fā)的影響 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表4。

表4 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響Table 4 Effects of malic acid and citric acid on seed germination of Solanum pseudocapsicum under copper stress

從表4可知，當(dāng)蘋(píng)果酸濃度為5 mmol/L時(shí)，珊瑚櫻種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都達(dá)到最大值，與Cu40處理種子相比分別提高24.02%，42.49%和50.49%，且均有顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)蘋(píng)果酸濃度為10 mmol/L時(shí)，珊瑚櫻種子發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)和芽長(zhǎng)均較Cu40處理顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明低濃度蘋(píng)果酸能緩解銅脅迫對(duì)珊瑚櫻種子萌發(fā)的抑制作用，而高濃度蘋(píng)果酸會(huì)抑制珊瑚櫻種子發(fā)芽后的芽苗生長(zhǎng)。銅脅迫下不同濃度檸檬酸僅能提高珊瑚櫻種子發(fā)芽率，與Cu40處理相比，1，3，5，10 mmol/L檸檬酸處理種子發(fā)芽率分別提高5.25%,9.68%,10.78%和11.90%，而對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和芽長(zhǎng)等指標(biāo)均無(wú)緩解作用。表明蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)有一定緩解作用，且蘋(píng)果酸的緩解效果顯著優(yōu)于檸檬酸。

2.4 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子根系活力的影響

從圖1-A可知，隨蘋(píng)果酸濃度增加，珊瑚櫻根系活力呈先增后減趨勢(shì)，當(dāng)蘋(píng)果酸濃度為5 mmol/L時(shí)，根系活力最大為1.79 mg/(g·h)，顯著高于Cu40處理(P<0.05)，其余均顯著低于Cu40處理。從圖1-B可知，隨檸檬酸濃度增加，珊瑚櫻根系活力呈下降趨勢(shì)，均顯著低于Cu40處理(P<0.05)，檸檬酸濃度為10 mmol/L時(shí)，珊瑚櫻種子發(fā)芽后芽苗停止生長(zhǎng)，即檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻根系活力的降低沒(méi)有起到緩解作用。

2.5 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)影響的綜合評(píng)價(jià)

2.5.1 萌發(fā)特性的相關(guān)性分析 從表5可知，蘋(píng)果酸濃度與珊瑚櫻發(fā)芽勢(shì)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與芽長(zhǎng)和根系活力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。檸檬酸濃度與活力指數(shù)、芽長(zhǎng)和根系活力均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與其他指標(biāo)相關(guān)性均不顯著。

表5 蘋(píng)果酸和檸檬酸與銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)特性的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of malic acid,citric acid and seed germination characteristics of Solanum pseudocapsicum under copper stress

2.5.2 萌發(fā)指標(biāo)的主成分分析 以不同濃度蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表6所示。由表6可知，從蘋(píng)果酸緩解銅脅迫(Cu40)各指標(biāo)中提取出2個(gè)主成分，主成分1貢獻(xiàn)率為73.84%，主成分2貢獻(xiàn)率為20.16%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)94.00%，其中主成分1載荷最高的是活力指數(shù)(0.437 92)，其次是發(fā)芽勢(shì)(0.406 53)；主成分2載荷最高的是發(fā)芽率(0.738 14)。從檸檬酸緩解銅脅迫各影響指標(biāo)中只提取了1個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率為85.90%，以活力指數(shù)(0.400 52)載荷最高。

表6 蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)指標(biāo)的主成分分析Table 6 Principal component analysis on the influence of malic acid and citric acid on various indexes of seed germination of Solanum pseudocapsicum under copper stress

2.5.3 萌發(fā)影響的聚類(lèi)分析 為進(jìn)一步篩選蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)緩解作用的最佳濃度，對(duì)種子萌發(fā)各指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2-A可知，在歐氏距離為15時(shí)，將不同濃度蘋(píng)果酸處理聚為2類(lèi)，其中以0，1和10 mmol/L 為第Ⅰ類(lèi)，3和5 mmol/L為第Ⅱ類(lèi)，表明蘋(píng)果酸為3和5 mmol/L時(shí)緩解效果較好。從圖2-B可知，在歐氏距離為10時(shí)，將不同濃度檸檬酸處理聚為兩類(lèi)，其中以0 mmol/L為第Ⅰ類(lèi)，1～10 mmol/L為第Ⅱ類(lèi)，表明檸檬酸對(duì)銅脅迫(Cu40)下珊瑚櫻種子萌發(fā)緩解效果不佳。

3 討 論

種子能否正常萌發(fā)和成苗決定著植物種群的繁衍與生存[20]，在萌發(fā)過(guò)程中其易受外界環(huán)境影響，重金屬污染是其中最重要的影響因素。但也有植物表現(xiàn)出對(duì)重金屬的超強(qiáng)耐受性，如蓖麻[21]種子在銅鋅復(fù)合質(zhì)量濃度為1 320 mg/L時(shí)仍未死亡，表明其對(duì)Cu2+和Zn2+復(fù)合脅迫具有很強(qiáng)的耐受性。本研究發(fā)現(xiàn)，隨銅質(zhì)量濃度增加，珊瑚櫻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及芽長(zhǎng)等指標(biāo)均呈現(xiàn)出低促高抑現(xiàn)象，與在高羊茅[22]和水稻[23]上的研究結(jié)果一致。當(dāng)銅質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，珊瑚櫻種子發(fā)芽率顯著受抑，活力指數(shù)和芽長(zhǎng)的受抑程度均達(dá)到50%，故將此視為半致死濃度。

蘋(píng)果酸和檸檬酸是植物體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和常見(jiàn)的有機(jī)酸，也是植物生理代謝的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有著顯著影響[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蘋(píng)果酸濃度為5 mmol/L時(shí)，珊瑚櫻種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均達(dá)到最大值；蘋(píng)果酸濃度與發(fā)芽勢(shì)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與芽長(zhǎng)和根系活力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。表明低濃度蘋(píng)果酸能緩解銅脅迫對(duì)珊瑚櫻種子萌發(fā)的抑制作用，而高濃度蘋(píng)果酸會(huì)抑制珊瑚櫻種子發(fā)芽后芽苗的生長(zhǎng)，這與在甜瓜[24]、蕎麥[25]和杉木[6]上的研究結(jié)果一致。主成分分析表明，活力指數(shù)可作為評(píng)價(jià)有機(jī)酸緩解銅脅迫(Cu40)對(duì)珊瑚櫻種子萌發(fā)影響的重要參數(shù)；聚類(lèi)分析進(jìn)一步表明，3和5 mmol/L蘋(píng)果酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)的緩解效果較佳。對(duì)不同濃度檸檬酸緩解銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)各指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，銅脅迫下檸檬酸僅能提高珊瑚櫻種子發(fā)芽率，而對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和芽長(zhǎng)等指標(biāo)的影響較小，此結(jié)果與在水稻[26]、黑麥草[27]和番茄[7]上的研究結(jié)果不一致。檸檬酸濃度與珊瑚櫻種子活力指數(shù)、芽長(zhǎng)和根系活力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而與其他指標(biāo)相關(guān)均不顯著。從聚類(lèi)分析結(jié)果可知，1～10 mmol/L檸檬酸聚為一類(lèi)，表明檸檬酸對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)受抑的緩解效果不佳。由此可知，不同濃度和pH有機(jī)酸對(duì)不同植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育的影響有別。

根系活力是反映植物根系生命活動(dòng)的一項(xiàng)指標(biāo)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果酸濃度與珊瑚櫻根系活力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，表明適宜濃度(5 mmol/L)蘋(píng)果酸能促進(jìn)珊瑚櫻根系生長(zhǎng)發(fā)育、緩解銅毒害，而高濃度蘋(píng)果酸反而會(huì)降低其根系活力，這與在油菜[28]、小白菜[29]和玉米[30]上的研究結(jié)果一致。不同濃度檸檬酸對(duì)銅脅迫抑制珊瑚櫻根系活力無(wú)顯著緩解效果，這與在蕎麥[31]上的研究結(jié)果不一致。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)珊瑚櫻果實(shí)中低分子量有機(jī)酸配制不同濃度蘋(píng)果酸、檸檬酸，分析其對(duì)銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨銅質(zhì)量濃度增加，珊瑚櫻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及芽長(zhǎng)等指標(biāo)表現(xiàn)出低促高抑現(xiàn)象。當(dāng)銅質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，珊瑚櫻種子發(fā)芽率顯著受抑(P<0.05)，且活力指數(shù)和芽長(zhǎng)受抑程度均達(dá)到50%。相關(guān)性分析表明，高濃度蘋(píng)果酸和檸檬酸會(huì)抑制珊瑚櫻種子發(fā)芽后芽苗的生長(zhǎng)。通過(guò)主成分分析和聚類(lèi)分析可知，活力指數(shù)可作為評(píng)價(jià)有機(jī)酸緩解銅脅迫下珊瑚櫻種子萌發(fā)受抑的重要參數(shù)，蘋(píng)果酸和檸檬酸對(duì)銅脅迫抑制珊瑚櫻種子萌發(fā)均有一定緩解作用，但蘋(píng)果酸的緩解效果顯著優(yōu)于檸檬酸，蘋(píng)果酸濃度為5 mmol/L時(shí)，對(duì)銅脅迫抑制珊瑚櫻種子萌發(fā)的緩解效果最佳。