刺梨總?cè)频拿庖呋钚匝芯?/h1>
2022-06-14 11:29:04李良群李艷梅牛振鵬李齊激楊小生
田 強(qiáng),李良群,彭 梅,李艷梅,牛振鵬,李齊激，汪 濤,楊小生
(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014)
藥食兩用植物資源由于存在天然的抗氧化和抗衰老等成分，在作為藥物治療疾病的同時(shí)兼有食品保健功能，因此引發(fā)越來(lái)越多科研人員的關(guān)注[1]。刺梨(RosaroxburghiiTratt.)為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的果實(shí)，別名野刺梨、野石榴、茨梨、文光果、油刺果等[2]。據(jù)文獻(xiàn)記載，刺梨味甘、酸澀、性平，歸脾、胃經(jīng)，具有健胃、消食、止瀉的作用，主治食積飽脹，腸炎腹瀉，并具滋補(bǔ)強(qiáng)壯之功效[3]。刺梨主要分布于貴州、云南、四川、湖南、湖北、陜西等地，其中貴州野生刺梨資源最為豐富，多分布在海拔1 000～1 600 m的山區(qū)丘陵地帶[4]。現(xiàn)代研究表明，刺梨富含維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)、黃酮、五環(huán)三萜、氨基酸、多糖等化學(xué)成分[5-7]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗癌等多種生物活性[8-13]。刺梨為藥食兩用植物資源，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和功效物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)[14-15]。
免疫功能障礙與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)[16-18]。最新研究表明，肆虐全球的新冠肺炎病毒(COVID-19)與宿主的免疫系統(tǒng)也具相互聯(lián)系，可以提高機(jī)體的免疫功能并有助于患者的康復(fù)[19]。刺梨總提物或刺梨汁由于具有抗氧化、改善機(jī)體免疫功能而表現(xiàn)出良好的免疫增強(qiáng)活性[20-24]，但目前對(duì)于刺梨中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，其中三萜類成分是否有免疫增強(qiáng)作用也有待進(jìn)一步研究。基于此，本試驗(yàn)研究了刺梨總?cè)茖?duì)免疫抑制小鼠的影響，結(jié)合RAW264.7巨噬細(xì)胞試驗(yàn)，從體內(nèi)外綜合評(píng)價(jià)刺梨總?cè)频拿庖呋钚?，初步探索其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)制，旨在為刺梨相關(guān)藥物和免疫保健功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材 料
刺梨鮮果采于貴州貴定敏子食品有限公司刺梨種植基地，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為薔薇科植物繅絲花(RosaroxburghiiTratt) 的果實(shí)。
SPF級(jí)昆明小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g/只，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：XSCXK(遼)2020-0001；小鼠腹腔RAW264.7巨噬細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。
注射用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide for injection,CTX)，百特國(guó)際有限公司；香菇多糖片(Lentinan,LNT)，武漢迪奧藥業(yè)有限公司；白介素IL-2、IL-4、IL-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒，博士德生物工程有限公司；酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞稀釋液，北京索萊寶科技有限公司；PBS緩沖液(pH 7.4)，BIOEXPLORER；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、雙抗(10 kU/mL青霉素+10 mg/mL鏈霉素組成的100×工作液)，Gibco；二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，美國(guó)Sigma公司；注射用氯化鈉，貴州科倫藥業(yè)有限公司；NO檢測(cè)試劑盒(Nitric Oxide Assay Kit)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
多功能酶標(biāo)儀,PerkinElmer公司；冷凍離心機(jī)，Centrifuge 5427 R；電子天平，上海菁海儀器有限公司；倒置光學(xué)顯微鏡，Nikon；-80 ℃超低溫冰箱、CO2培養(yǎng)箱，Thermo。
1.2 刺梨總?cè)频闹苽?/h3>
參考文獻(xiàn)[25]的方法制備刺梨總?cè)?TR)。
1.3 刺梨總?cè)茖?duì)免疫抑制小鼠的影響
1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將SPF級(jí)昆明小鼠(雌雄各半)于(25±2) ℃、光照12 h/d、相對(duì)濕度40%～45%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，取50只，按70 mg/(kg· d)的劑量腹腔注射CTX，連續(xù)注射7 d，構(gòu)建免疫抑制小鼠模型。將50只建模小鼠按雌雄各半隨機(jī)平均分為模型組(M)、陽(yáng)性對(duì)照組(P)以及總?cè)聘邉┝拷M(TH)、中劑量組(TM)和低劑量組(TL)，另取10只正常SPF小鼠作為空白對(duì)照組(B)。空白對(duì)照組和模型組小鼠按每10 g體質(zhì)量0.1 mL的劑量灌胃生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠以3 mg/kg劑量灌胃香菇多糖片；總?cè)聘?、中、低劑量組分別按200，100和50 mg/kg劑量灌胃刺梨總?cè)?。各組小鼠每天灌胃1次，連續(xù)14 d。末次給藥后禁食12 h，稱體質(zhì)量，眼眶靜脈叢采血，部分血樣用于全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)；其余血液冰浴靜置30 min，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取血清，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取脾臟和胸腺，稱質(zhì)量,備測(cè)。剪取小鼠的部分脾臟，用PBS沖洗干凈，用于制備組織切片，HE染色后觀察；其余脾臟樣品凍存于-80 ℃冰箱備用。
1.3.2 全血白細(xì)胞數(shù)測(cè)定 取0.5 mL離心管，加白細(xì)胞稀釋液380 μL，再加20 μL小鼠全血，立即混勻，待紅細(xì)胞完全破壞，液體變成棕褐色后，再次混勻，取10 μL沖池至細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，室溫靜置2～3 min，待白細(xì)胞沉淀后，置于顯微鏡低倍鏡下依次計(jì)數(shù)四角4個(gè)大方格內(nèi)的白細(xì)胞(N)，計(jì)算白細(xì)胞數(shù)：白細(xì)胞數(shù)=(N÷20)×109。
1.3.3 小鼠免疫器官指數(shù)測(cè)定 計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。
1.3.4 血清細(xì)胞因子水平和酶活力測(cè)定 取凍存的血清，用ELISA試劑盒分別測(cè)定IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α含量；按照試劑盒使用說(shuō)明，測(cè)定ACP和LDH活力。
1.3.5 抗氧化能力測(cè)定 取脾臟組織樣品約50 mg，用眼科剪盡快剪碎成組織塊，加入約9倍體積的生理鹽水，在勻漿管中勻漿，制備體積分?jǐn)?shù)10%的勻漿液。將脾臟勻漿液2 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定丙二醛(MDA)含量和過(guò)氧化氫酶(CAT)活力。
1.3.6 脾損傷觀察 將小鼠脾臟組織沖洗干凈，放入體積分?jǐn)?shù)4%的多聚糖甲醛溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察、拍照。
1.4 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響
1.4.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7接種于高糖DMEM完全培養(yǎng)基中(含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS和1%雙抗)，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整其密度為4×104mL-1，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔90 μL，過(guò)夜培養(yǎng)后，設(shè)置1.25，2.5，5，10，20 μg/mL(終質(zhì)量濃度)刺梨總?cè)平M及空白對(duì)照組，每組5孔重復(fù)。刺梨總?cè)平M每孔加相應(yīng)質(zhì)量濃度藥物10 μL，空白對(duì)照組加等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去上清液，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育4 h；棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振蕩混勻后于490 nm處測(cè)定吸光值(OD490)。設(shè)置3次獨(dú)立試驗(yàn)獲得最終結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(試驗(yàn)組OD490/空白對(duì)照組OD490)×100%。
1.4.2 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 將RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板，每孔450 μL，細(xì)胞接種量為5×105孔-1，培養(yǎng)過(guò)夜后，分為空白對(duì)照組、總?cè)芓R組、模型組及總?cè)频汀⒅?、高劑量組。模型組和總?cè)频?、中、高劑量組給予一定體積的LPS(終質(zhì)量濃度6 μg/mL)誘導(dǎo)，空白對(duì)照組和TR組用等量無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)足。2 h后，總?cè)频?、中、高劑量組加一定體積的總?cè)?，使其終質(zhì)量濃度分別為1.25，2.5，5 μg/mL，TR組給予總?cè)疲蛊浣K質(zhì)量濃度為5 μg/mL；空白對(duì)照組和模型組用等體積無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)足。給藥后于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔吸取50 μL培養(yǎng)上清液于96孔板中，重復(fù)3孔，按照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每孔分別添加GriessⅠ和GriessⅡ試劑各50 μL，振蕩混勻后，于540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其OD值(OD540)。設(shè)置3次獨(dú)立試驗(yàn)獲得最終結(jié)果。依照事先繪制的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線(按照NO檢測(cè)試劑盒繪制)，計(jì)算細(xì)胞上清液中的NO濃度。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)之間的差異采用單因素方差分析與Bonferroni校正。
2 結(jié)果與分析
2.1 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠全血白細(xì)胞數(shù)的影響
由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)，表明其免疫力減退，免疫抑制小鼠模型構(gòu)建成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频?、中、高劑量組小鼠血液中的白細(xì)胞數(shù)量均極顯著升高(P<0.01)，且不同劑量總?cè)平M高于陽(yáng)性對(duì)照組，表明刺梨總?cè)瓶商岣呙庖咭种菩∈蟮陌准?xì)胞數(shù)量，且效果優(yōu)于香菇多糖片。陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频?、中、高劑量組的白細(xì)胞數(shù)量雖低于空白對(duì)照組，但差異不明顯。
2.2 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響
由圖2可見(jiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明建模成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频蛣┝拷M胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)，總?cè)浦袆┝拷M和高劑量組胸腺指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，總?cè)频蛣┝拷M脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)浦?、高劑量組脾臟指數(shù)均極顯著升高(P<0.01)。與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频汀⒅袆┝拷M胸腺指數(shù)有所降低；陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)浦小⒏邉┝拷M脾臟指數(shù)略有升高，總?cè)频蛣┝拷M脾臟指數(shù)略有降低；但均無(wú)顯著性差異。
2.3 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠血清中免疫因子水平和酶活力的影響
由表1可以看出，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平均極顯著降低(P<0.01)，這說(shuō)明環(huán)磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能。與模型組相比，不同劑量總?cè)平M小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平升高(除低劑量組IL-4水平外)，尤其是IL-2和IL-6水平升高明顯，均達(dá)顯著水平，這說(shuō)明刺梨總?cè)瓶梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平改善由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制。
表1 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響(n=10)Table 1 Effects of total triterpenes from Rosa roxburghii Tratt in serum cytokine content of mice(n=10)
由圖3可知，模型組小鼠血清中的ACP和LDH活力均極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频汀⒅?、高劑量組的ACP活力均極顯著提高(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)聘邉┝拷M的LDH活力極顯著提高(P<0.01)。該結(jié)果表明，刺梨總?cè)瓶缮险{(diào)免疫抑制小鼠體內(nèi)ACP和LDH的活力。
2.4 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠脾臟抗氧化能力的影響
刺梨總?cè)茖?duì)小鼠MDA含量和CAT活力的影響見(jiàn)圖4。
由圖4可知，在本試驗(yàn)設(shè)置的6個(gè)組中，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠脾臟中的MDA含量極顯著升高(P<0.01)，CAT活力極顯著降低(P<0.01)，表明建模成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频?、中、高劑量組的MDA含量均極顯著降低(P<0.01)，CAT活力均極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，刺梨總?cè)瓶商岣呙庖咭种菩∈蟮目寡趸芰Α?/p>
2.5 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠脾損傷的影響
染色觀察結(jié)果(圖5)顯示，空白對(duì)照組(B組)小鼠的脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列未見(jiàn)異常。模型組(M組)脾臟組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列無(wú)序。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組(P組)和刺梨總?cè)频?、中、高劑量組(TL、TM、TH組)細(xì)胞較多，排列緊密。結(jié)果表明，刺梨總?cè)瓶梢跃徑庥蒀TX所致的免疫器官損傷。
2.6 刺梨總?cè)茖?duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響
由圖6可以看出，與空白對(duì)照組(0 μg/mL刺梨總?cè)?相比，刺梨總?cè)铺幚斫M小鼠巨噬細(xì)胞的增殖率均升高，當(dāng)刺梨總?cè)频慕K質(zhì)量濃度為1.25～5 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞增殖率顯著或極顯著升高。
2.7 刺梨總?cè)茖?duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響
由圖7可知，TR組NO含量與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異，表明刺梨總?cè)?5 μg/mL)單獨(dú)作用RAW264.7細(xì)胞時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞NO的分泌量沒(méi)有影響?？?cè)频汀⒅?、高劑量組NO含量較模型組明顯降低，其中高劑量組差異達(dá)顯著水平，表明總?cè)瓶山档蚅PS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的NO分泌。結(jié)果提示，刺梨總?cè)凭哂袧撛诘目寡谆钚浴?/p>
3 討論與結(jié)論
免疫器官和免疫細(xì)胞因子水平、相關(guān)酶的變化是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的表現(xiàn)[26]。CTX是一種常用的免疫抑制劑，可降低機(jī)體的免疫器官指數(shù)及淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的活性[27-29]。本研究通過(guò)給小鼠腹腔注射CTX構(gòu)建免疫抑制模型，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的全血白細(xì)胞數(shù)量及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著降低，說(shuō)明免疫抑制小鼠模型建模成功。
胸腺、脾臟作為重要的免疫器官，與機(jī)體的免疫功能緊密相關(guān)。血液白細(xì)胞數(shù)量和免疫器官變化是機(jī)體免疫功能變化最直觀的反映，當(dāng)免疫功能受到抑制時(shí)，常伴隨著白細(xì)胞數(shù)量和免疫器官指數(shù)的降低[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，總?cè)圃囼?yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)量和胸腺脾臟指數(shù)顯著或極顯著升高，脾臟組織中的細(xì)胞數(shù)量和排列情況得到了極大改善，說(shuō)明刺梨總?cè)颇芫徑釩TX對(duì)胸腺、脾臟的損傷，提升免疫細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。
巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)非常重要的一類免疫細(xì)胞，其作用是吞噬、殺滅外來(lái)病原體并釋放細(xì)胞因子而參與免疫應(yīng)答，而ACP和LDH的活性能夠直觀地反映巨噬細(xì)胞的激活程度[31-33]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，刺梨總?cè)聘鲃┝拷M小鼠的ACP活力極顯著增強(qiáng)，高劑量組的LDH活力極顯著升高(P<0.01)，這說(shuō)明刺梨總?cè)瓶梢哉{(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)的ACP和LDH活力。另外，體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.25～5 μg/mL刺梨總?cè)瓶娠@著或極顯著促進(jìn)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的增殖。在用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型基礎(chǔ)上，檢測(cè)巨噬細(xì)胞的NO分泌量可用于評(píng)價(jià)藥物潛在的抗炎活性[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，刺梨總?cè)浦苯幼饔糜诰奘杉?xì)胞，對(duì)細(xì)胞的NO分泌量無(wú)顯著影響，但可顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的NO分泌量。這表明刺梨總?cè)凭哂袧撛诘目寡酌庖呋钚裕渚唧w的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。
細(xì)胞因子具有多種免疫功能，并參與免疫調(diào)節(jié)。小鼠Th1亞群分泌產(chǎn)生IL-2，Th2亞群分泌產(chǎn)生IL-4，IL-2和IL-4均能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，且IL-4還可以增強(qiáng)B細(xì)胞的提呈抗原能力，提升IgG1和IgE水平，使免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)[35-37]。IL-6和TNF-α是巨噬細(xì)胞主要的細(xì)胞因子，IL-6存在于多種免疫反應(yīng)中，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、分化；TNF-α作為促炎細(xì)胞因子，能直接殺滅腫瘤細(xì)胞，參與宿主的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[38-39]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，刺梨總?cè)铺幚硇∈笱逯蠭L-2、IL-4、IL-6和TNF-α的含量整體明顯升高，說(shuō)明其可通過(guò)影響小鼠血清中的免疫細(xì)胞因子水平而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
MDA是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，對(duì)體內(nèi)自由基代謝異常反應(yīng)較為靈敏[40]；CAT可以減少毒性氫氧自由基的形成，保護(hù)抗氧化系統(tǒng)[41-42]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，刺梨總?cè)铺幚斫M小鼠脾臟組織的MDA含量極顯著降低(P<0.01)，而CAT極顯著增強(qiáng)(P<0.01)，說(shuō)明刺梨總?cè)瓶梢酝ㄟ^(guò)提升小鼠抗氧化應(yīng)激能力而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
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田 強(qiáng),李良群,彭 梅,李艷梅,牛振鵬,李齊激，汪 濤,楊小生
(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014)
藥食兩用植物資源由于存在天然的抗氧化和抗衰老等成分，在作為藥物治療疾病的同時(shí)兼有食品保健功能，因此引發(fā)越來(lái)越多科研人員的關(guān)注[1]。刺梨(RosaroxburghiiTratt.)為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的果實(shí)，別名野刺梨、野石榴、茨梨、文光果、油刺果等[2]。據(jù)文獻(xiàn)記載，刺梨味甘、酸澀、性平，歸脾、胃經(jīng)，具有健胃、消食、止瀉的作用，主治食積飽脹，腸炎腹瀉，并具滋補(bǔ)強(qiáng)壯之功效[3]。刺梨主要分布于貴州、云南、四川、湖南、湖北、陜西等地，其中貴州野生刺梨資源最為豐富，多分布在海拔1 000～1 600 m的山區(qū)丘陵地帶[4]。現(xiàn)代研究表明，刺梨富含維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)、黃酮、五環(huán)三萜、氨基酸、多糖等化學(xué)成分[5-7]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗癌等多種生物活性[8-13]。刺梨為藥食兩用植物資源，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和功效物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)[14-15]。
免疫功能障礙與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)[16-18]。最新研究表明，肆虐全球的新冠肺炎病毒(COVID-19)與宿主的免疫系統(tǒng)也具相互聯(lián)系，可以提高機(jī)體的免疫功能并有助于患者的康復(fù)[19]。刺梨總提物或刺梨汁由于具有抗氧化、改善機(jī)體免疫功能而表現(xiàn)出良好的免疫增強(qiáng)活性[20-24]，但目前對(duì)于刺梨中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，其中三萜類成分是否有免疫增強(qiáng)作用也有待進(jìn)一步研究。基于此，本試驗(yàn)研究了刺梨總?cè)茖?duì)免疫抑制小鼠的影響，結(jié)合RAW264.7巨噬細(xì)胞試驗(yàn)，從體內(nèi)外綜合評(píng)價(jià)刺梨總?cè)频拿庖呋钚?，初步探索其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)制，旨在為刺梨相關(guān)藥物和免疫保健功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材 料
刺梨鮮果采于貴州貴定敏子食品有限公司刺梨種植基地，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為薔薇科植物繅絲花(RosaroxburghiiTratt) 的果實(shí)。
SPF級(jí)昆明小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g/只，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：XSCXK(遼)2020-0001；小鼠腹腔RAW264.7巨噬細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。
注射用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide for injection,CTX)，百特國(guó)際有限公司；香菇多糖片(Lentinan,LNT)，武漢迪奧藥業(yè)有限公司；白介素IL-2、IL-4、IL-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒，博士德生物工程有限公司；酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞稀釋液，北京索萊寶科技有限公司；PBS緩沖液(pH 7.4)，BIOEXPLORER；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、雙抗(10 kU/mL青霉素+10 mg/mL鏈霉素組成的100×工作液)，Gibco；二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，美國(guó)Sigma公司；注射用氯化鈉，貴州科倫藥業(yè)有限公司；NO檢測(cè)試劑盒(Nitric Oxide Assay Kit)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
多功能酶標(biāo)儀,PerkinElmer公司；冷凍離心機(jī)，Centrifuge 5427 R；電子天平，上海菁海儀器有限公司；倒置光學(xué)顯微鏡，Nikon；-80 ℃超低溫冰箱、CO2培養(yǎng)箱，Thermo。
1.2 刺梨總?cè)频闹苽?/h3>
參考文獻(xiàn)[25]的方法制備刺梨總?cè)?TR)。
1.3 刺梨總?cè)茖?duì)免疫抑制小鼠的影響
1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將SPF級(jí)昆明小鼠(雌雄各半)于(25±2) ℃、光照12 h/d、相對(duì)濕度40%～45%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，取50只，按70 mg/(kg· d)的劑量腹腔注射CTX，連續(xù)注射7 d，構(gòu)建免疫抑制小鼠模型。將50只建模小鼠按雌雄各半隨機(jī)平均分為模型組(M)、陽(yáng)性對(duì)照組(P)以及總?cè)聘邉┝拷M(TH)、中劑量組(TM)和低劑量組(TL)，另取10只正常SPF小鼠作為空白對(duì)照組(B)。空白對(duì)照組和模型組小鼠按每10 g體質(zhì)量0.1 mL的劑量灌胃生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠以3 mg/kg劑量灌胃香菇多糖片；總?cè)聘?、中、低劑量組分別按200，100和50 mg/kg劑量灌胃刺梨總?cè)?。各組小鼠每天灌胃1次，連續(xù)14 d。末次給藥后禁食12 h，稱體質(zhì)量，眼眶靜脈叢采血，部分血樣用于全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)；其余血液冰浴靜置30 min，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取血清，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取脾臟和胸腺，稱質(zhì)量,備測(cè)。剪取小鼠的部分脾臟，用PBS沖洗干凈，用于制備組織切片，HE染色后觀察；其余脾臟樣品凍存于-80 ℃冰箱備用。
1.3.2 全血白細(xì)胞數(shù)測(cè)定 取0.5 mL離心管，加白細(xì)胞稀釋液380 μL，再加20 μL小鼠全血，立即混勻，待紅細(xì)胞完全破壞，液體變成棕褐色后，再次混勻，取10 μL沖池至細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，室溫靜置2～3 min，待白細(xì)胞沉淀后，置于顯微鏡低倍鏡下依次計(jì)數(shù)四角4個(gè)大方格內(nèi)的白細(xì)胞(N)，計(jì)算白細(xì)胞數(shù)：白細(xì)胞數(shù)=(N÷20)×109。
1.3.3 小鼠免疫器官指數(shù)測(cè)定 計(jì)算小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。
1.3.4 血清細(xì)胞因子水平和酶活力測(cè)定 取凍存的血清，用ELISA試劑盒分別測(cè)定IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α含量；按照試劑盒使用說(shuō)明，測(cè)定ACP和LDH活力。
1.3.5 抗氧化能力測(cè)定 取脾臟組織樣品約50 mg，用眼科剪盡快剪碎成組織塊，加入約9倍體積的生理鹽水，在勻漿管中勻漿，制備體積分?jǐn)?shù)10%的勻漿液。將脾臟勻漿液2 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定丙二醛(MDA)含量和過(guò)氧化氫酶(CAT)活力。
1.3.6 脾損傷觀察 將小鼠脾臟組織沖洗干凈，放入體積分?jǐn)?shù)4%的多聚糖甲醛溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察、拍照。
1.4 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響
1.4.1 對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7接種于高糖DMEM完全培養(yǎng)基中(含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS和1%雙抗)，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整其密度為4×104mL-1，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔90 μL，過(guò)夜培養(yǎng)后，設(shè)置1.25，2.5，5，10，20 μg/mL(終質(zhì)量濃度)刺梨總?cè)平M及空白對(duì)照組，每組5孔重復(fù)。刺梨總?cè)平M每孔加相應(yīng)質(zhì)量濃度藥物10 μL，空白對(duì)照組加等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去上清液，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育4 h；棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振蕩混勻后于490 nm處測(cè)定吸光值(OD490)。設(shè)置3次獨(dú)立試驗(yàn)獲得最終結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(試驗(yàn)組OD490/空白對(duì)照組OD490)×100%。
1.4.2 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 將RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板，每孔450 μL，細(xì)胞接種量為5×105孔-1，培養(yǎng)過(guò)夜后，分為空白對(duì)照組、總?cè)芓R組、模型組及總?cè)频汀⒅?、高劑量組。模型組和總?cè)频?、中、高劑量組給予一定體積的LPS(終質(zhì)量濃度6 μg/mL)誘導(dǎo)，空白對(duì)照組和TR組用等量無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)足。2 h后，總?cè)频?、中、高劑量組加一定體積的總?cè)?，使其終質(zhì)量濃度分別為1.25，2.5，5 μg/mL，TR組給予總?cè)疲蛊浣K質(zhì)量濃度為5 μg/mL；空白對(duì)照組和模型組用等體積無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)足。給藥后于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔吸取50 μL培養(yǎng)上清液于96孔板中，重復(fù)3孔，按照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每孔分別添加GriessⅠ和GriessⅡ試劑各50 μL，振蕩混勻后，于540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其OD值(OD540)。設(shè)置3次獨(dú)立試驗(yàn)獲得最終結(jié)果。依照事先繪制的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線(按照NO檢測(cè)試劑盒繪制)，計(jì)算細(xì)胞上清液中的NO濃度。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)之間的差異采用單因素方差分析與Bonferroni校正。
2 結(jié)果與分析
2.1 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠全血白細(xì)胞數(shù)的影響
由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)，表明其免疫力減退，免疫抑制小鼠模型構(gòu)建成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频?、中、高劑量組小鼠血液中的白細(xì)胞數(shù)量均極顯著升高(P<0.01)，且不同劑量總?cè)平M高于陽(yáng)性對(duì)照組，表明刺梨總?cè)瓶商岣呙庖咭种菩∈蟮陌准?xì)胞數(shù)量，且效果優(yōu)于香菇多糖片。陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频?、中、高劑量組的白細(xì)胞數(shù)量雖低于空白對(duì)照組，但差異不明顯。
2.2 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響
由圖2可見(jiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明建模成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频蛣┝拷M胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.05)，總?cè)浦袆┝拷M和高劑量組胸腺指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，總?cè)频蛣┝拷M脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)浦?、高劑量組脾臟指數(shù)均極顯著升高(P<0.01)。與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频汀⒅袆┝拷M胸腺指數(shù)有所降低；陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)浦小⒏邉┝拷M脾臟指數(shù)略有升高，總?cè)频蛣┝拷M脾臟指數(shù)略有降低；但均無(wú)顯著性差異。
2.3 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠血清中免疫因子水平和酶活力的影響
由表1可以看出，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平均極顯著降低(P<0.01)，這說(shuō)明環(huán)磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能。與模型組相比，不同劑量總?cè)平M小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平升高(除低劑量組IL-4水平外)，尤其是IL-2和IL-6水平升高明顯，均達(dá)顯著水平，這說(shuō)明刺梨總?cè)瓶梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平改善由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制。
表1 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響(n=10)Table 1 Effects of total triterpenes from Rosa roxburghii Tratt in serum cytokine content of mice(n=10)
由圖3可知，模型組小鼠血清中的ACP和LDH活力均極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频汀⒅?、高劑量組的ACP活力均極顯著提高(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)聘邉┝拷M的LDH活力極顯著提高(P<0.01)。該結(jié)果表明，刺梨總?cè)瓶缮险{(diào)免疫抑制小鼠體內(nèi)ACP和LDH的活力。
2.4 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠脾臟抗氧化能力的影響
刺梨總?cè)茖?duì)小鼠MDA含量和CAT活力的影響見(jiàn)圖4。
由圖4可知，在本試驗(yàn)設(shè)置的6個(gè)組中，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠脾臟中的MDA含量極顯著升高(P<0.01)，CAT活力極顯著降低(P<0.01)，表明建模成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和總?cè)频?、中、高劑量組的MDA含量均極顯著降低(P<0.01)，CAT活力均極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，刺梨總?cè)瓶商岣呙庖咭种菩∈蟮目寡趸芰Α?/p>
2.5 刺梨總?cè)茖?duì)小鼠脾損傷的影響
染色觀察結(jié)果(圖5)顯示，空白對(duì)照組(B組)小鼠的脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列未見(jiàn)異常。模型組(M組)脾臟組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列無(wú)序。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組(P組)和刺梨總?cè)频?、中、高劑量組(TL、TM、TH組)細(xì)胞較多，排列緊密。結(jié)果表明，刺梨總?cè)瓶梢跃徑庥蒀TX所致的免疫器官損傷。
2.6 刺梨總?cè)茖?duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響
由圖6可以看出，與空白對(duì)照組(0 μg/mL刺梨總?cè)?相比，刺梨總?cè)铺幚斫M小鼠巨噬細(xì)胞的增殖率均升高，當(dāng)刺梨總?cè)频慕K質(zhì)量濃度為1.25～5 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞增殖率顯著或極顯著升高。
2.7 刺梨總?cè)茖?duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響
由圖7可知，TR組NO含量與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異，表明刺梨總?cè)?5 μg/mL)單獨(dú)作用RAW264.7細(xì)胞時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞NO的分泌量沒(méi)有影響?？?cè)频汀⒅?、高劑量組NO含量較模型組明顯降低，其中高劑量組差異達(dá)顯著水平，表明總?cè)瓶山档蚅PS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的NO分泌。結(jié)果提示，刺梨總?cè)凭哂袧撛诘目寡谆钚浴?/p>
3 討論與結(jié)論
免疫器官和免疫細(xì)胞因子水平、相關(guān)酶的變化是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的表現(xiàn)[26]。CTX是一種常用的免疫抑制劑，可降低機(jī)體的免疫器官指數(shù)及淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的活性[27-29]。本研究通過(guò)給小鼠腹腔注射CTX構(gòu)建免疫抑制模型，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的全血白細(xì)胞數(shù)量及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著降低，說(shuō)明免疫抑制小鼠模型建模成功。
胸腺、脾臟作為重要的免疫器官，與機(jī)體的免疫功能緊密相關(guān)。血液白細(xì)胞數(shù)量和免疫器官變化是機(jī)體免疫功能變化最直觀的反映，當(dāng)免疫功能受到抑制時(shí)，常伴隨著白細(xì)胞數(shù)量和免疫器官指數(shù)的降低[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，總?cè)圃囼?yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)量和胸腺脾臟指數(shù)顯著或極顯著升高，脾臟組織中的細(xì)胞數(shù)量和排列情況得到了極大改善，說(shuō)明刺梨總?cè)颇芫徑釩TX對(duì)胸腺、脾臟的損傷，提升免疫細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。
巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)非常重要的一類免疫細(xì)胞，其作用是吞噬、殺滅外來(lái)病原體并釋放細(xì)胞因子而參與免疫應(yīng)答，而ACP和LDH的活性能夠直觀地反映巨噬細(xì)胞的激活程度[31-33]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，刺梨總?cè)聘鲃┝拷M小鼠的ACP活力極顯著增強(qiáng)，高劑量組的LDH活力極顯著升高(P<0.01)，這說(shuō)明刺梨總?cè)瓶梢哉{(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)的ACP和LDH活力。另外，體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.25～5 μg/mL刺梨總?cè)瓶娠@著或極顯著促進(jìn)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的增殖。在用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型基礎(chǔ)上，檢測(cè)巨噬細(xì)胞的NO分泌量可用于評(píng)價(jià)藥物潛在的抗炎活性[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，刺梨總?cè)浦苯幼饔糜诰奘杉?xì)胞，對(duì)細(xì)胞的NO分泌量無(wú)顯著影響，但可顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的NO分泌量。這表明刺梨總?cè)凭哂袧撛诘目寡酌庖呋钚裕渚唧w的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。
細(xì)胞因子具有多種免疫功能，并參與免疫調(diào)節(jié)。小鼠Th1亞群分泌產(chǎn)生IL-2，Th2亞群分泌產(chǎn)生IL-4，IL-2和IL-4均能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，且IL-4還可以增強(qiáng)B細(xì)胞的提呈抗原能力，提升IgG1和IgE水平，使免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)[35-37]。IL-6和TNF-α是巨噬細(xì)胞主要的細(xì)胞因子，IL-6存在于多種免疫反應(yīng)中，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、分化；TNF-α作為促炎細(xì)胞因子，能直接殺滅腫瘤細(xì)胞，參與宿主的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[38-39]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，刺梨總?cè)铺幚硇∈笱逯蠭L-2、IL-4、IL-6和TNF-α的含量整體明顯升高，說(shuō)明其可通過(guò)影響小鼠血清中的免疫細(xì)胞因子水平而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
MDA是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，對(duì)體內(nèi)自由基代謝異常反應(yīng)較為靈敏[40]；CAT可以減少毒性氫氧自由基的形成，保護(hù)抗氧化系統(tǒng)[41-42]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，刺梨總?cè)铺幚斫M小鼠脾臟組織的MDA含量極顯著降低(P<0.01)，而CAT極顯著增強(qiáng)(P<0.01)，說(shuō)明刺梨總?cè)瓶梢酝ㄟ^(guò)提升小鼠抗氧化應(yīng)激能力而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
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