應(yīng)用同位素標記相對和絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選漿細胞性乳腺炎病人差異表達蛋白質(zhì)

陳波 趙侃侃 盧文亮 鄭媛

漿細胞性乳腺炎(plasma cell mastitis,PCM)又稱導(dǎo)管周圍炎或?qū)Ч軘U張癥，常發(fā)生于非哺乳期婦女,其發(fā)病機制目前仍未完全明確[1-2],其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，易反復(fù)，臨床誤診率較高，治療難度較大，國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的診療指南。探索PCM的發(fā)病機制和病理生理過程對治療具有重要意義。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)，標記效率高、標記過程簡單、靈敏度高、適用范圍廣[3]。本研究應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，探索PCM組織的蛋白譜，并通過生物信息學(xué)分析，篩選差異蛋白、進行功能富集分析，研究差異蛋白可能的功能，初步鑒定出在PCM發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵分子。報道如下。

對象與方法

一、對象

PCM病人病灶組織(4例)和對應(yīng)的鄰近正常組織(對照組)均來自湖北省婦幼保健院甲乳外科進行手術(shù)治療的病人。均經(jīng)過病理檢查證實為PCM。

二、方法

1.蛋白提取：對4例PCM病人的病灶組織及病灶旁正常組織樣本用遇冷的PBS清洗，冰浴超聲5分鐘，離心后取上清，加等體積的100%乙腈溶液，混合均勻，冰上放置1小時;沉淀完成后離心，取上清液，冷凍收干至體積縮小一半后，用預(yù)先潤濕的10 KD超濾管10 000 g，4 ℃離心，再用200 μl超純水重復(fù)上述操作。收集穿透液，加入1%的甲酸調(diào)pH至2～3。取2 μl蛋白樣品，稀釋到合適倍數(shù)，用Bradford法測定蛋白濃度。

2.iTRAQ標記和分級分離：取酶解除鹽后的肽段，根據(jù)iTRAQ-8標試劑盒(SCIEX)說明書進行標記，樣本標記后混合，然后將混合后的肽段運用Ultimate 3000 HPLC系統(tǒng)(Thermo DINOEX,USA)對肽段樣品進行分級分離。

3.LC-MS/MS分析：分離后的肽段樣品，使用與EKsigent nanoLC系統(tǒng)(AB SCIEX,USA)偶聯(lián)的Triple TOF 5600 plus質(zhì)譜儀進行分析。本研究使用的是武漢金瑞開有限公司蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺。質(zhì)譜下機數(shù)據(jù)利用Protein Pilot 4.5軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索分析。

4.生物信息學(xué)分析：對蛋白質(zhì)鑒定的基本流程為選出可信蛋白，根據(jù)分析模式組合數(shù)據(jù)，選出可分析蛋白，選出差異蛋白。本研究中，PCM差異蛋白標準為：adj.P-value≤ 0.05情況下，差異倍數(shù)≥2.0(表達上調(diào))或差異倍數(shù)≤0.50(表達下調(diào))。差異蛋白的功能富集分析采用GO和KEGG進行注釋?；虮倔w論(Gene Ontology,GO)是一個國際標準化的基因功能分類體系，包括分子功能(molecular function)，細胞組分(cellular component)，生物學(xué)過程(biological process)。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)是有關(guān)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫。通過KEGG分析，能確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

結(jié)果

1.iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選的PCM中差異表達的蛋白：應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對PCM組織和正常組織進行蛋白組學(xué)分析，見圖1。根據(jù)預(yù)先設(shè)置的差異蛋白的標準，在PCM中，915個蛋白表達量發(fā)生顯著變化(上調(diào)795個蛋白，下調(diào)120個蛋白)。差異最顯著的10種蛋白，以及這些蛋白的功能見表1。

表1 PCM與對照組織排名前10的差異表達蛋白及功能富集分析

圖1 PCM與對照組織差異表達蛋白火山圖

2.差異蛋白功能富集分析結(jié)果：在PCM中差異表達的蛋白質(zhì)主要功能見圖2。這些差異表達的蛋白質(zhì)主要參與的生物學(xué)過程包括細胞細胞黏附、糖酵解、翻譯起始、調(diào)控炎癥反應(yīng)、對真菌的防疫反應(yīng)、細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)等過程。這些差異蛋白主要參與形成的細胞學(xué)組分包括細胞外泌體，細胞外基質(zhì)、細胞質(zhì)、細胞膜、線粒體等。這些差異蛋白質(zhì)的主要功能包括結(jié)合RNA，介導(dǎo)細胞細胞黏附、結(jié)合蛋白激酶、結(jié)合MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合物等。

圖2 差異蛋白GO富集分析

3.差異蛋白KEGG通路富集結(jié)果：在PCM中差異表達的蛋白質(zhì)主要參與的信號通路見圖3。其中，代謝通路中，差異蛋白主要參與碳水化合物代謝通路、脂質(zhì)代謝通路、能量代謝通路等。此外，差異蛋白還參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和死亡、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、感染性疾病、腫瘤、免疫性疾病等信號通路。

圖3 差異蛋白KEGG分析

討論

PCM的病因未明，病程較長，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，極易錯過最佳治療時機，部分病人最后不得不行乳房切除[4]。給病人身心健康造成造成嚴重影響。因此，從蛋白質(zhì)組學(xué)層面探索影響PCM病理生理的關(guān)鍵分子具有重要意義。本研究通過iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選到915個差異表達蛋白，并通過生物信息學(xué)的方法分析了這些差異蛋白可能的功能和信號通路。

有研究表明，PCM與自身免疫系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)[5-10]。PCM的病理基礎(chǔ)是由多種原因引起的乳腺導(dǎo)管擴張，導(dǎo)管上皮細胞破壞、脫落，角化的碎屑和脂質(zhì)分泌物堵塞管腔，從而刺激乳腺導(dǎo)管壁周圍產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，漿細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及泡沫細胞等慢性炎性細胞浸潤[8]。我們的研究支持上述研究結(jié)論。在PCM中，KEGG通路分析表明我們篩選到的差異蛋白主要參與免疫系統(tǒng)相關(guān)通路。蛋白結(jié)構(gòu)域分析也表明這些差異蛋白主要富集在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。因此，免疫系統(tǒng)功能與PCM的發(fā)生、發(fā)展值得進一步的研究。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白參與感染性疾病(細菌，病毒和寄生蟲)相關(guān)通路。關(guān)于PCM與感染的關(guān)系，存在很大爭議。有研究在PCM病人組織中培養(yǎng)出多種類型的細菌、真菌以及分枝桿菌[11-13]。也有研究表明，PCM組織中細菌檢出率和正常對照組織無明顯差異[14]。本研究結(jié)果表明，在PCM組織中差異表達的蛋白質(zhì)顯著富集在感染性疾病相關(guān)通路。說明感染在PCM的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。

本研究樣本量偏小是其局限性。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析PCM蛋白表達譜，篩選出了一些關(guān)鍵作用的分子，為后續(xù)縮小研究范圍提供了參考。